Alteraciones específicas de la Enfermedad de Alzheimer de la relación de fosforilación ERK1/ERK2 como biomarcadores moleculares específicos de la Enfermedad de Alzheimer (ADSMB).
Procedimiento de identificación de un compuesto líder útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimerque comprende:
a) poner en contacto células que no son de la Enfermedad de Alzheimer con un péptido beta amiloide, en elque dichas células que no son de la Enfermedad de Alzheimer muestran ausencia de la Enfermedad deAlzheimer porque dichas células extraídas de un individuo no muestran un fenotipo medible o detectablede la Enfermedad de Alzheimer;
b) poner en contacto dichas células de la etapa (a) con un agente que es un activador de la proteína quinasaC;
c) poner en contacto dichas células de la etapa (b) con un compuesto de ensayo; y
d) determinar el valor de un biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer para identificarun compuesto líder útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.
en el que el valor de dicho biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer se mide mediantela determinación de la relación de Erk1 fosforilada y Erk2 fosforilada en células que han sido estimuladas con unactivador de proteína quinasa C y restando de éste la relación de Erk1 fosforilada y Erk2 fosforilada en célulasque han sido estimuladas con una solución de control que carece de activador de proteína quinasa C; yel valor de dicho biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer es indicativo de uncompuesto útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer si dicho valor es inferior que el valor de dichobiomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer medido en células de control que no se hanpuesto en contacto con dicho compuesto de ensayo.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08020258.
Solicitante: BLANCHETTE ROCKEFELLER NEUROSCIENCES INSTITUTE.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: P.O. BOX 9301 MEDICAL CENTER DRIVE MORGANTOWN, WV 26596-9301 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: ALKON, DANIEL, L., KHAN,TAPAN,KUMAR.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
- G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
PDF original: ES-2412268_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Alteraciones específicas de la Enfermedad de Alzheimer de la relación de fosforilación ERK1/ERK2 como biomarcadores moleculares específicos de la Enfermedad de Alzheimer (ADSMB)
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento de cribado para compuestos líderes que pueden utilizarse para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer. La presente invención también se refiere a la detección de alteraciones en la relación de proteínas MAP quinasas fosforiladas específicas en células después de la estimulación con un activador de la proteína quinasa C. Los Biomarcadores Moleculares Específicos de la Enfermedad de Alzheimer (ADSMB) descritos en el presente documento son útiles para la identificación de compuestos líderes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La perturbación de la homeostasis del calcio intracelular, el aumento de los niveles de estrés oxidativo y los mecanismos inflamatorios que resultan en toxicidad excitatoria y muerte neuronal se ha sugerido que contribuyen a la patogénesis de la Enfermedad de Alzheimer (AD) (Ito y otros. 1994, Putney, 2000; Yoo y otros, 2000; Sheehan y otros, 1997; De Luigi y otros, 2001; Anderson y otros, 2001; Remarque y otros, 2001) . Una serie de anormalidades asociadas con AD en los niveles de Ca2+ intracelulares y otros procesos celulares se han derivado de los estudios que utilizan la bradiquinina como estímulo. Como potente mediador de la inflamación, la bradiquinina (BK) es producida por las células del cerebro y periféricas en condiciones fisiopatológicas tales como traumatismo, accidente cerebrovascular, isquemia dolorosa y asma (Regoli y otros, 1993; Bockmann y Paegelow, 2000; Ellis y otros, 1989; Kamiya y otros, 1993) . Al actuar sobre el receptor de bradicinina B2 (BK2bR) , un receptor acoplado a la proteína G, BK desencadena la conversión de fosfatidilinositol (PI) mediante la actividad de la fosfolipasa C (PLC) , que a su vez produce 1, 4, 5-trisfosfato de inositol (IP3) que aumenta la liberación de Ca2+ intracelular de los almacenes sensibles a IP3 (Noda y otros, 1996; Venema y otros, 1998; Wassdal y otros, 1999; Cruzblanca y otros, 1998; Ricupero y otros, 1997; Pascale y otros, 1999) . A través de la misma vía, BK también desencadena la producción de otras citoquinas proinflamatorias mediante la activación de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAP) (Hayashi y otros, 2000; Schwaninger y otros, 1999; Phagoo y otros, 2001) . Se ha encontrado un aumento mejorado de los niveles de Ca2+ intracelulares en cerebros con AD, así como en células periféricas de AD en respuesta a la estimulación de bradiquinina y la inactivación de canales de K+ (Etcheberrigaray y otros, 1993, 1998; Hirashima y otros, 1996; Gibson y otros, 1996 (a) ) .
La estimulación de PLC posterior a la activación de BK2bR también conduce a la producción de diacilglicerol que, junto con el aumento de Ca2+ intracelular, activa isoformas de la proteína quinasa C (PKC) . La cascada PLC/fosfolípidos-Ca2+/ PKC activada por BK interactúa con la vía de señalización Ras/Raf, que activa las quinasas reguladas por señales extracelulares 1/2 (Erk 1 y Erk2, a las que se hace referencia en conjunto como "Erk1/2") , un subtipo de la familia de quinasas MAP (Berridge, 1984; Bassa y otros, 1999; Hayashi y otros, 2000; Blaukat y otros, 2000, Zhao y otros. Neurobiology of Disease 11, 166-183, 2002) . Erk1/2 recibe señales de múltiples vías de transducción de señales y conduce a la proliferación celular y a la diferenciación por la regulación de la expresión génica a través varios factores transcripcionales, incluyendo AP-1, NF-KB, y de la proteína de unión al elemento de respuesta a AMP cíclica (CREB) . Al actuar como una de las quinasas principales, Erk2 fosforila tau en múltiples sitios serina/treonina incluyendo Ser-262 y Ser-356 (Reynolds y otros, 1993; Lu y otros, 1993) . Además, la quinasa MAP activada por PKC y las vías asociadas a receptores BK se ha demostrado que regulan la formación y secreción de la forma soluble de la proteína precursora de amiloide (sAPP) por diferentes laboratorios (Desdouits-Magnen y otros, 1998; Gasparini y otros, 2001; Nitsch y otros, 1994, 1995, 1996, 1998) . Estos descubrimientos han sugerido la posibilidad de que el procesamiento de sAPP asociado a BK puede estar vinculado a la vía de la quinasa MAP-PKC. Por otro lado, estados patológicos, tales como infecciones virales, aumento de estrés oxidativo, expresión aberrante de APP y exposición a Apº, provocan la activación de la quinasa MAP (Rodems y Spector, 1998; McDonald y otros, 1998; Ekinci y otros, 1999; Grant y otros, 1999) y mejoran la fosforilación tau (Greenberg y otros, 1994; Ekinci y Shea, 1999; Knowles y otros, 1999) . Estos efectos implican el desarreglo de una vía o vías de señalización de quinasa MAP en la patogénesis de la AD.
Las proteínas quinasas activadas por mitógeno (tales como Erk1 y Erk2) regulan la fosforilación de la proteína tau asociada a microtúbulos y el procesamiento de la proteína º amiloide, siendo ambos eventos críticos para la patofisiología de la Enfermedad de Azheimer. La fosforilación de Erk1/2 mejorada y prolongada en respuesta a la bradiquinina se ha detectado en fibroblastos de la Enfermedad de Alzheimer tanto familiar como esporádica, pero no en controles de la misma edad (Zhao y otros. Neurobiology of Disease 11, 166-183, 2002) . La fosforilación de Erk1/2 sostenida inducida por bradicinina ha sido encontrada previamente en fibroblastos de la Enfermedad de Alzheimer y es el objeto de la solicitud de Patente internacional WO 02/067764, que se incorpora en su totalidad en el presente documento como referencia.
Existe la necesidad de disponer de ensayos muy específicos y muy sensibles para diagnosticar la Enfermedad de Alzheimer y para cribar compuestos útiles en el tratamiento y prevención de la Enfermedad de Alzheimer. Los presentes inventores han identificado, por primera vez, biomarcadores moleculares específicos de la Enfermedad de Alzheimer únicos útiles para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer de una manera muy sensible y muy específica en comparación con los ensayos de diagnóstico conocidos anteriormente. Por lo tanto, los biomarcadores moleculares específicos de la Enfermedad de Alzheimer únicos descritos en el presente documento sirven como base para procedimientos de diagnóstico que tienen un alto grado de sensibilidad y especificidad para la detección y el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer. Los biomarcadores moleculares específicos de la Enfermedad de Alzheimer únicos de la presente invención también son útiles en procedimientos de cribado para identificar compuestos que pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento y la prevención de la Enfermedad de Alzheimer.
La solicitud de Patente internacional WO 03/102016 A2 da a conocer una enzima que inactiva el péptido amiloide para tratar la Enfermedad de Alzheimer y se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto candidato para utilizar en la reducción de la formación o crecimiento de la placa amiloide o para reducir la neurotoxicidad del péptido amiloide que comprende: (a) evaluar el efecto de un compuesto de ensayo en la expresión de un ARNm de una enzima que inactiva el péptido amiloide (APIE) en una célula del sistema nervioso o célula derivada del sistema nervioso; y (b) identificar un compuesto de ensayo como un compuesto candidato para utilizar en la reducción de la formación o crecimiento de la placa amiloide o para reducir la neurotoxicidad del péptido amiloide si el compuesto mejora la expresión del ARNm de APIE. Se utilizaron células de pacientes con la Enfermedad de Alzheimer para evaluar el aumento de la expresión y actividad de las enzimas que inactiva el péptido amiloide en el cerebro.
La solicitud de Patente internacional WO 02/067764 A2 da a conocer un procedimiento de diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente que comprende determinar si el nivel de fosforilación de una proteína indicadora en células de pacientes después de un estímulo con un compuesto activador es anomalmente elevada en comparación con un nivel de fosforilación basal, siendo la proteína indicadora, por ejemplo, Erk1/2 y siendo el compuesto activador, por ejemplo, bradiquinina.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto líder útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas, tal como se definen en la reivindicación 1.
En una realización de la presente invención, el péptido beta amiloide es A (1-42) , aunque se puede utilizar cualquier péptido beta amiloide. En otra realización de la presente invención, las células que no... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de identificación de un compuesto líder útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer 5 que comprende:
a) poner en contacto células que no son de la Enfermedad de Alzheimer con un péptido beta amiloide, en el que dichas células que no son de la Enfermedad de Alzheimer muestran ausencia de la Enfermedad de Alzheimer porque dichas células extraídas de un individuo no muestran un fenotipo medible o detectable de la Enfermedad de Alzheimer; b) poner en contacto dichas células de la etapa (a) con un agente que es un activador de la proteína quinasa C; c) poner en contacto dichas células de la etapa (b) con un compuesto de ensayo; y d) determinar el valor de un biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer para identificar
un compuesto líder útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.
en el que el valor de dicho biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer se mide mediante la determinación de la relación de Erk1 fosforilada y Erk2 fosforilada en células que han sido estimuladas con un activador de proteína quinasa C y restando de éste la relación de Erk1 fosforilada y Erk2 fosforilada en células que han sido estimuladas con una solución de control que carece de activador de proteína quinasa C; y el valor de dicho biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer es indicativo de un compuesto útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer si dicho valor es inferior que el valor de dicho biomarcador molecular específico de la Enfermedad de Alzheimer medido en células de control que no se han puesto en contacto con dicho compuesto de ensayo.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho péptido beta amiloide es A (1-42) .
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichas células que no son de la Enfermedad de Alzheimer
se seleccionan del grupo que comprende fibroblastos, saliva, sangre, orina, células de la piel, células de la mucosa 30 bucal y fluido cerebroespinal.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho activador de proteína quinasa C se selecciona del grupo que comprende bradiquinina, briostatina, bombesina, colecistoquinina, trombina, prostaglandina F2a y vasopresina.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichas células de control se han puesto en contacto con un péptido beta amiloide.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que dicho péptido beta amiloide es A (1-42) . 40
7. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 5, en el que dichas células de control se han puesto en contacto con un agente que es un activador de la proteína quinasa C.
8. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de modificar dicho compuesto
identificado como útil para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer para optimizar o mejorar su seguridad y eficacia en comparación con la seguridad y la eficacia del compuesto no modificado.
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