Un anticuerpo monoclonal humano, o una mezcla, monómero o fragmento activo del mismo,

caracterizado por su capacidad para unirse a oligodendrocitos, o un anticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad para unirse a los oligodendrocitos, con las características siguientes:

(a) capaz de inducir remielinización;

(b) capaz de estimular la proliferación celular de células gliales; y

(c ) capaz de estimular la señalización de Ca++ en los oligodendrocitos;

y que tiene:

un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo A o de tipo B como se establece en la Figura 17 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo I o de tipo II como se indica en la Figura 18;

un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como establece en la Figura 19 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como se establece en la Figura 20;

un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HigM CB2bG8 como se establece en la Figura 27 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HIgM CB2bG8 como se establece en la Figura 28

Anticuerpos IgM humanos con la capacidad de inducir remielinización y usos diagnósticos y terapéuticos de los mismos, particularmente en el sistema nervioso central Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al campo de la neurobiología, y, más particularmente, a la identificación de autoanticuerpos que desempeñan un papel en la función y terapia del sistema nervioso central. La invención también se refiere a materiales y procedimientos diagnósticos y terapéuticos, incluidos, a modo de ejemplo, composiciones farmacéuticas, autoanticuerpos para usar en procedimientos de tratamientos de enfermedades asociadas con la alteración neurológica, autoanticuerpos para usar en procedimientos de regeneración y restauración de la función neural, ensayos de detección selectiva y vacunas.

Antecedentes de la invención

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) crónica, con frecuencia progresiva, que se caracteriza patológicamente por desmielinización primaria, normalmente sin lesión axonal inicial. La etiología y patogenia de la EM se desconocen. Varias características inmunológicas de la EM y su moderada asociación con ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad ha urgido la especulación de que la EM es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario.

Una hipótesis de autoinmunidad está avalada por el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAR) , en el que la inyección de ciertos componentes de mielina en animales genéticamente susceptibles conduce a la desmielinización del SNC mediada por linfocitos T. No obstante, en el SNC de los pacientes de EM no se han identificado definitivamente los autoantígenos específicos y linfocitos T reactivos a mielina patogénica ni la EM se asocia con otras enfermedades autoinmunitarias. Una hipótesis alternativa, en base a los datos epidemiológicos, es que un factor ambiental, quizá un virus no identificado, desencadena una respuesta inflamatoria en el SNC, que conduce a la destrucción directa o indirecta ("espectador") de mielina, potencialmente con un componente autoinmunitario inducido. Esta hipótesis viene avalada por las pruebas de que varias infecciones víricas naturales, tanto en seres humanos como en animales, pueden producir desmielinización. Un modelo de virus experimental de uso habitual se induce con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) (Dal Canto, M.C., y Lipton, H.L., Am. J. Path., 88:497-500 (1977) ) .

En Kirschning y col. (J. Neuroimmunology 99:122-130) se demostró que varios anticuerpos monoclonales (AcMo) murinos de tipo IgM que estimulan la remielinización en ratones que eran autoanticuerpos naturales codificados por genes de la línea germinal que reaccionan con los oligondendrocitos y los antígenos intracelulares. El AcMo de tipo IgM DS1F8 reactivo con oligodendrocitos humanos derivado de un paciente con esclerosis múltiple, que es similar a los AcMo murinos, está dirigido a estructuras de tipo microtúbulo. Estas similitudes del AcMo DS1F8 con los AcMo murinos que estimulan la remielinización sugieren que este AcMo humano es un autoanticuerpo natural.

Asakura y col. (Neurology 54:Suppl 3 PP A126-127) enseña que los autoanticuerpos naturales que reaccionan con los antígenos del SNC pueden estimular la remielinización.

Bansal y col. (J. Neuro Res 21:260-267) divulga un procedimiento de simulación de la diferenciación de oligondendrocitos usando el AcMo 04.

La limitada eficacia de los tratamientos actuales para la EM y otras enfermedades desmielinizantes ha estimulado el interés en nuevas terapias para aliviar estas enfermedades. No obstante, debido a la aparentemente compleja etiopatogenia de estas enfermedades que implican potencialmente a factores ambientales y autoinmunitarios, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz de estos trastornos desmielinizantes.

Se sabe que un grupo de autoanticuerpos exhiben actividad en el sistema nervioso central y que estaba particularmente asociado con la estimulación de la remielinización. Uno de los objetivos de los solicitantes ha sido investigar el amplio abanico de actividades de los anticuerpos y, de forma concomitante, identificar otros miembros de la clase que demuestran dichas actividades. En consecuencia, la presente invención está dirigida a la satisfacción de estos y otros objetivos.

La mención de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como admisión de que dicha referencia está disponible como "Técnica anterior" a la presente solicitud.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona (reivindicación 1) , en el presente documento se han identificado y analizado anticuerpos concretos, y la invención se extiende, en consecuencia, a autoanticuerpos humanos, de modo que son ejemplos de autoanticuerpos humanos sHIgM22 (LIM 22) , sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10 y CB2bG8. La invención también proporciona, en otro aspecto, un ensayo para la detección selectiva de otros anticuerpos y parejas de unión relacionadas, incluidos haptenos y análogos peptídicos, que pueden exhibir una actividad terapéutica similar. Dichas actividades incluirían el tratamiento o prevención de lesiones o disfunciones neurológicas, tal como esclerosis múltiple, ELA, ictus, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer.

La presente invención se refiere, en otro aspecto, a la promoción o estimulación de la regeneración o remielinización de los axones del sistema nervioso central en un mamífero. Específicamente, la presente invención se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de estimulación de la remielinización de los axones sistema nervioso central (SNC) , incluidos anticuerpos del subtipo IgM y monómeros de la misma, y, en particular, a autoanticuerpos humanos, o mezclas y/o fragmentos activos de los mismos, que se caracterizan por su capacidad para unirse a estructuras y células dentro del sistema nervioso central. La presente invención también se extiende a la preparación y uso de autoanticuerpos humanos, en el que son ejemplos de los autoanticuerpos humanos sHIgM22 (LYM 22) , sHIgM46, ebvHIgM, MSI19D10 y CB2bG8. Las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de ejemplo se exponen en las Figuras del siguiente modo: LYM 22 se expone en las Figuras 17 y 18 (SEC ID Nº 1, 5, 49 y 50) ; MSI19D10 se expone en las Figuras 19 y 20 (SEC ID Nº 9 y 11) ; CB2bG8 se expone en las Figuras 27 y 28 (SEC ID Nº 13 y 15) ;

La invención se extiende a anticuerpos y a las correspondientes proteínas de anticuerpos y a moléculas pequeñas, tales como haptenos, que tienen, o corresponden al menos en parte a, las secuencias expuestas en las Figuras indicadas.

La presente invención usa un análisis de las secuencias de ADNc de la región variable de la Ig y la capacidad de unirse a estructuras y células en el sistema nervioso central, incluidos, entre otros, oligondendrocitos, de estos AcMo para determinar su utilidad en los procedimientos descritos en el presente documento. Además, este trabajo proporciona confirmación de la utilidad genérica de este grupo de autoanticuerpos como eficaces en la producción de la remielinización del sistema nervioso central De acuerdo con una realización adicional de la invención, y como se ha indicado anteriormente, se ha definido una clase más amplia de anticuerpos y se divulga en el presente documento. Específicamente, de acuerdo con el presente documento también se divulgan y preparan autoanticuerpos monoclonales y policlonales humanos que proporcionan mayor afinidad por tejido neural y capacidad tanto diagnóstica como terapéutica. La invención se extiende más allá en cuanto a que los anticuerpos recién identificados se pueden usar para varios fines, tales como la estimulación de la remielinización, regeneración de células nerviosas dañadas, protección neuronal, sobrecrecimiento neuronal y similares.

Una característica y ventaja significativa de la presente invención reside en la fuente de anticuerpos, ya que pueden obtenerse directamente del huésped o paciente y usarse después para estimular autoterapias más seguras. Más ampliamente, el desarrollo de anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantes, péptidos, moléculas pequeñas y similares, en base a estos materiales endógenos reduce, si no elimina, posibles enfermedades o disfunciones, tales como reacciones autoinmunitarias, que pueden ser el resultado de la introducción in vivo y uso de materiales exógenos. Asimismo, el origen endógeno... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano, o una mezcla, monómero o fragmento activo del mismo, caracterizado por su capacidad para unirse a oligodendrocitos, o un anticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad para unirse a los oligodendrocitos, con las características siguientes:

(a) capaz de inducir remielinización;

(b) capaz de estimular la proliferación celular de células gliales; y

(c ) capaz de estimular la señalización de Ca++ en los oligodendrocitos;

y que tiene:

un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo A o de tipo B como se establece en la Figura 17 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo I o de tipo II como se indica en la Figura 18;

un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como establece en la Figura 19 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como se establece en la Figura 20;

un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HigM CB2bG8 como se establece en la Figura 27 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HIgM CB2bG8 como se establece en la Figura 28;

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, que es del subtipo IgM.

3. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que deriva de células humanas.

4. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para usar en:

(a) estimulación de la remielinización de los axones del sistema nervioso central en un mamífero que necesite dicha terapia; o

(b) tratar una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central en un mamífero que necesite dicha terapia.

5. El anticuerpo monoclonal para uso de la reivindicación 4, para usar en la prevención y/o tratamiento de debilitaciones celulares, desorganizaciones y/o disfunciones y/u otros estados de enfermedad en mamíferos, incluidos seres humanos, e incluidas las afecciones del SNC como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad desmielinizante viral, una enfermedad del sistema nervioso central y otras afecciones del sistema nervioso central en las que los nervios se han dañado por un traumatismo, una enfermedad desmielinizante viral o una enfermedad posnatal del sistema nervioso central en un ser humano o animal doméstico, tal como un ratón infectado con la cepa DA del virus de la encefalomielitis murina de Theiler.

6. Un procedimiento in vitro de estimular la proliferación de células gliales de cultivos mixtos, que comprende:

(a) cultivar un cultivo celular mixto que contiene células gliales en condiciones suficientes para proliferación celular;

(b) introducir en el cultivo mixto una cantidad eficaz de un autoanticuerpo monoclonal humano, un fragmento humano del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad de unirse a oligodendrocitos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de modo que se produce un cultivo mixto tratado con anticuerpo monoclonal;

(c) mantener el cultivo de la etapa (b) en condiciones suficientes para proliferación de células tratadas con el anticuerpo monoclonal, de modo que tiene como resultado la proliferación de las células gliales en el cultivo mixto; y

(d) recoger las células gliales del cultivo mixto.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el cultivo mixto se obtiene del nervio óptico de rata o de cerebro de rata.

8. Una composición farmacéutica que comprende, como agente activo, un autoanticuerpo monoclonal humano, un fragmento activo del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad de unirse a oligodendrocitos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. La composición de la reivindicación 8, que se adapta para administración intravenosa o intraperitoneal.

10. La composición de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que la cantidad de anticuerpo monoclonal que se va a administrar es de 0, 5 mg/kg a 400 mg/kg.

11. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, marcado con un marcador detectable.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que el marcador es una enzima, un producto químico que es fluorescente o un elemento radioactivo.

13. Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica al menos un dominio variable de un autoanticuerpo monoclonal humano, un fragmento activo del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad de unirse a oligodendrocitos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico es ADN, tal como ADNc o ADN genómico o es ARN.

15. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 13 o de la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor de la transcripción del ARN.

16. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, en el que el promotor comprende un promotor de bacteria, levadura, insecto, viral o de mamífero.

17. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha secuencia de ADN está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.

18. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 17, en el que dicha secuencia de ADN está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión es el promotor temprano o tardío de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, un operador principal y la región promotora del fago A, una región de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa, un promotor de la fosfatasa ácida

o un promotor de un factor de apareamiento de levaduras.

19. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.

20. El vector de la reivindicación 19 que es una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN como se define en la reivindicación 14.

21. El vector de la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que el vector es un plásmido, un cósmido, cromosoma artificial de levadura (YAC) , bacteriófago o ADN viral eucariótico.

22. Una sonda de ácido nucleico capaz de seleccionar un autoanticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento activo del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo, en especies alternativas preparadas de la secuencia de ADN del dominio variable de la reivindicación 14, en el que dicha sonda hibrida con una secuencia de codificación del dominio variable de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones de hibridación estrictas.

23. Un sistema vector del huésped para la producción de un polipéptido que comprende el vector de la reivindicación 19 o la reivindicación 20 en una célula huésped adecuada.

24.El sistema vector del huésped de la reivindicación 23, en el que la célula huésped adecuada comprende una célula procariota o eucariota.

25. El sistema vector del huésped de la reivindicación 23, en el que la célula huésped es E. coli, una Pseudomonas, un Bacillus, un Streptomyces, una levadura, una célula CHO, RI, 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, o BMT10, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula humana en cultivo tisular..

26.Un virus recombinante transformado con el ácido nucleico asilado de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17.

27. Un procedimiento de obtención de un polipéptido en forma purificada, que comprende:

(a) cultivar un sistema de vector del huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, para producir el polipéptido;

(b) recuperar el polipéptido producido en la etapa (a) ; y

(c ) purificar el polipéptido recuperado de este modo en la etapa (b) .

28. Un procedimiento para detectar la presencia de una cantidad de una anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho procedimiento comprende:

(a) colocar una muestra que contiene una forma marcada de dicho anticuerpo monoclonal en contacto con una muestra biológica de un mamífero en el que se sospechan los sitios de unión para dicho anticuerpo monoclonal; y (b) examinar en dicha muestra biológica en estudios de unión la presencia de dicho anticuerpo monoclonal marcado; en el que la presencia o cantidad de dicho anticuerpo monoclonal marcado se indica o detecta.

29. Un procedimiento para analizar la capacidad de un fármaco u otra entidad para modular la actividad de un anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a) cultivar una colonia de células de ensayo que tiene un receptor para el anticuerpo monoclonal en un medio de 10 crecimiento que contiene el anticuerpo monoclonal;

(b) añadir un fármaco que se va a analizar; y (c ) medir la reactividad de dicho anticuerpo monoclonal con el receptor en dicha colonia de células de ensayo.

30. Un kit de ensayo para demostrar la presencia de un anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una muestra celular eucariota, que comprende:

(a) una cantidad predeterminada de dicho anticuerpo monoclonal;

(b) una cantidad predeterminada de una pareja de unión específica de dicho anticuerpo monoclonal seleccionado de células gliales y oligodendrocitos cultivados;

(c) otros reactivos; y

(d) instrucciones de uso de dicho kit; en el que dicho anticuerpo monoclonal o dicha pareja de unión específica se 20 marcan de forma detectable.