Un procedimiento para su uso con sangre extraída, que comprende:

aplicar sangre a un primer gradiente adecuado para seleccionar células de primer pase que tienen una densidad menor de 1,077 g/ml; aplicar las células del primer pase a un segundo gradiente adecuado para seleccionar células de segundo pase que tienen una densidad entre 1,055 y 1,074 g/ml; aumentar el número de células que tienen una densidad entre 1,055 y 1,074 g/ml cultivando las células de segundo pase durante un periodo que dura entre 1 y 30 días en un medio de cultivo que comprende uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en: suero autólogo, VEGF, b-FGF, IGF y heparina; para proporcionar una población de células cultivadas enriquecida en células progenitoras hematopoyéticas y en particular en células progenitoras endoteliales (CPE).

Referencias Cruzadas a Solicitudes Relacionadas

La presente solicitud reivindica beneficio de prioridad de:

(a) Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 60/576.266 presentada el 1 de Junio de 2004, titulada “Técnicas in vitro para su uso con células madre” y

(b) Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 60/588.520, presentada el 15 julio de 2004, titulada “Indicaciones para uso de células madre”.

Estas dos solicitudes se asignan al cesionario de la presente solicitud de patente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a procedimientos y aparatos para el tratamiento de pacientes humanos que padecen trastornos vasculares y específicamente a procedimientos y aparatos para facilitar la angiogénesis y/o neovascularización y/o vasculogénesis.

Antecedentes de la invención

Debido al estrechamiento de las arterias por depósitos grasos u otras anomalías vasculares se produce cierta disfunción arterial. Esto puede interferir con el flujo sanguíneo y/o evitar que los tejidos y órganos se abastezcan con suficientes nutrientes y oxígeno.

Los trastornos vasculares son afecciones habituales y pueden afectar gravemente a la calidad de vida de un paciente. A pesar de avances considerables en la terapia médica y mejoras en los procedimientos de revascularización para disfunción arterial, tales como injerto de arteria coronaria, angioplastia de globo y endoprótesis vasculares de los vasos coronarios, una proporción sustancial de pacientes padece enfermedad derivada de disfunción arterial.

Se han usado células progenitoras endoteliales (CPE) para tratar pacientes que padecen enfermedades vasculares. En tales casos graves, cuando los fármacos o los procedimientos de revascularización directa ya no son eficaces o no pueden usarse, se requieren terapias alternativas. Se han aplicado CPE a tejido isquémico. Las CPE tienen la capacidad de diferenciarse para formar endotelio, la capa de células que forma los vasos sanguíneos. Estas células están implicadas en los procesos de reendotelización, neovascularización, vasculogénesis y angiogénesis. Los mecanismos por los que las CPE implantadas pueden convertirse en parte del proceso de curación incluyen autorrepoblación, fusión con células del tejido dañado y secreción de citocinas y factores de crecimiento. La repoblación de CPE y su diferenciación a células endoteliales maduras activa sus funciones en los procesos de reendotelización, neovascularización, vasculogénesis y angiogénesis. Pruebas recientes sugieren que la fusión de CPE con células de tejido dañado potencia la regeneración de función tisular. Además, después de la secreción de citocinas y factores de crecimiento, las CPE pueden influir en la supervivencia celular de células inherentes al tejido y pueden ayudar a la movilización de células madre al tejido dañado.

Una célula ancestro común, el hemangioblasto, da lugar a precursores tanto endoteliales como hematopoyéticos (células sanguíneas). Esta célula ancestro se diferencia en células madre hematopoyéticas y angioblastos, que son células precursoras mesodérmicas, que se diferencian para dar precursoras endoteliales. Estas células tienen la capacidad de proliferar, migrar y diferenciarse en células endoteliales, pero no han adquirido aún marcadores endoteliales maduros específicos. Después de su compromiso al linaje endotelial, los angioblastos se ensamblan en un plexo vascular primitivo de venas y arterias, en un proceso llamado vasculogénesis. Esta vasculatura primitiva se refina posteriormente en una red funcional por angiogénesis y por remodelación y arteriogénesis de vasos de nueva formación. Se ha mostrado que las CPE se movilizan (es decir, migran en mayores números desde la médula ósea (MO) a la circulación) en pacientes con traumatismo vascular o infarto de miocardio agudo (IMA). (Véase, por ejemplo, los siguientes dos artículos (a) Gill, M., S. Dias, y col. (2001), "Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2(+)AC133(+) endothelial precursor cells," Circ Res 88(2): 167-74; y (b) Shintani, S., T. Murohara, y col. (2001), "Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction," Circulation 103(23): 2776-9). En general, el uso de CPE se dirige a promover la formación de derivaciones naturales dentro del tejido isquémico o cicatrizado y aliviar de este modo la afección clínica de estos pacientes.

Numerosos experimentos con animales y ensayos clínicos han investigado el potencial de esta terapia para aumentar el flujo sanguíneo y producir un alivio asociado de síntomas isquémicos, según se manifiesta por la mejora de un paciente en su actuación física.

Se han descrito diversas fuentes para CPE autólogas para trasplante, incluyendo células madres aspiradas directamente de la médula ósea (MO) y células madre de sangre periférica derivadas de MO.

Las células progenitoras, o las células madre, incluyen células de médula ósea que pueden multiplicarse, migrar y diferenciarse en una amplia diversidad de tipos celulares. Las células madre hematopoyéticas de médula ósea se caracterizan porque son “positivas para CD34” (CD34+), es decir, que expresan el marcador CD34.

Se supone que la plasticidad de poblaciones bien definidas de progenitores hematopoyéticos les permite transdiferenciarse en respuesta a estímulos ambientales presentes en el órgano diana y, más específicamente, a convertirse en células endoteliales.

El trasplante de médula ósea es clínicamente atrayente debido a la relativa simplicidad del procedimiento médico. Implica la aspiración de médula ósea de la cresta iliaca y la inmediata reinyección del aspirado o células seleccionadas en la cicatriz post infarto. Sin embargo, el procedimiento es invasivo y debe realizarse con anestesia.

La primera prueba que indica la presencia de CPE en la circulación del adulto se obtuvo cuando se mostró que células sanguíneas mononucleares de voluntarios humanos sanos adquirían el fenotipo de tipo célula endotelial in vitro y se incorporaban a capilares in vivo (véase Asahara, T., T. Murohara, y col. (1997), "Isolation of putative progenitor endotelial cells for angiogenesis," Science 275(5302): 964-7).

Estas CPE potenciales se caracterizaron mediante expresión de CD34 y receptor de factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR-2/KDR), dos antígenos compartidos por progenitores endoteliales embrionarios y células madre hematopoyéticas (HSC). Además de CD34, las células progenitoras hematopoyéticas tempranas expresan CD133. (AC133), que no se expresa después de la diferenciación. Actualmente, la definición ampliamente aceptada de CPE en circulación es, para fines prácticos, células CD34+/VEGFR-2+ o CD133+/VEGFR-2+.

Pueden obtenerse CPE de sangre periférica a partir de sangre de pacientes no tratados o de pacientes tratados para aumentar la movilización de CPE usando citocinas tales como factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), factor estimulador de colonias de monocitos y granulocitos (GM-CSF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Los tratamientos de movilización se evitan normalmente en pacientes que padecen trastornos derivados arteriales y hematológicos. También se ha indicado en tratamientos tales como inhibidores de HMG CoA reductasa (estatinas) elevan los números de CPE en circulación. Véase, por ejemplo:

1. Dimmeler S., y col. (2001), "HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway," J. Clin. Invest 108: 391-397.

2. Hyun-Jae, Hyo-Soo Kim, y col. (2003), "Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilized with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infraction: the MAGIC cell randomized clinical trial," The Lancet 363: 751-756.

3. Brigit Assmus, Volker Schachinger y col., (2002), "Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infraction (TOPCARE-AMI)," Circulation 106: 3009-3017.

4. Alexandra Aicher, Winfreid Brenner, y col., (2003), "Assessment of the tissue distribution of transplanted human endothelial progenitor cells by radioactive labeling," Circulation 107: 2134-2139.

El procedimiento para retirar sangre periférica es más simple y más... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para su uso con sangre extraída, que comprende:

aplicar sangre a un primer gradiente adecuado para seleccionar células de primer pase que tienen una densidad menor de 1,077 g/ml;

aplicar las células del primer pase a un segundo gradiente adecuado para seleccionar células de segundo pase que tienen una densidad entre 1,055 y 1,074 g/ml;

aumentar el número de células que tienen una densidad entre 1,055 y 1,074 g/ml cultivando las células de segundo pase durante un periodo que dura entre 1 y 30 días en un medio de cultivo que comprende uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en: suero autólogo, VEGF, b-FGF, IGF y heparina; para proporcionar una población de células cultivadas enriquecida en células progenitoras hematopoyéticas y en particular en células progenitoras endoteliales (CPE).

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende adicionalmente identificar las CPE en la población de células cultivadas.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que las células de segundo pase se cultivan durante un periodo que dura entre 3 y 30 días.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer gradiente comprende una solución que incluye un copolímero de sacarosa y epiclorohidrina.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo gradiente comprende una solución acuosa de iodixanol.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo gradiente comprende una solución de densidad gradual que incluye coloides de sílice revestidos de polivinilpirrolidona.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer gradiente comprende un gradiente de tipo Ficoll.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo gradiente comprende un gradiente de tipo Percoll.