PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA LA SÍNTESIS EN FASE SOPORTADA.

Procedimiento para la síntesis en fase sólida de péptidos, caracterizado porque al menos una de las etapas de lavado se efectúa en presencia de una sal (X n+ )m(Y m- )n,

en donde X representa un catión, n representa la carga del catión, Y representa un anión y m representa la carga del anión, y en donde dicha sal se elige del grupo consistente en sales de amonio cuaternario, líquidos iónicos, sales de fosfonio, sales de sulfonio, sales inorgánicas o cualquier mezcla de las mismas

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la síntesis en fase soportada.

En la síntesis en fase sólida (SPS), también llamada síntesis en fase soportada, se ensambla un oligómero sobre un soporte uniendo de manera secuencial monómeros adecuadamente protegidos u otros oligómeros. Esto se efectúa mediante etapas secuenciales de acoplamiento y desprotección, eventualmente separadas por ciclos de lavado.

El monómero es un bloque de construcción de la molécula a ensamblar sobre el soporte. Por ejemplo, pero no de forma limitativa, el monómero es un aminoácido adecuadamente protegido, un nucleótido adecuadamente protegido, un ácido nucleico peptídico adecuadamente protegido, un sacárido adecuadamente protegido o cualquier estructura estrechamente modificada de la misma familia.

El oligómero es una estructura producida ensamblando al menos dos o más de los monómeros de una misma familia o una combinación de los mismos. La definición de oligómero comprende bio-oligómeros, los cuales incluyen, pero no de forma limitativa, péptidos, oligonucleótidos (DNA, RNA), oligosacáridos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o una combinación de los mismos. El oligómero puede ser lineal o ramificado.

El soporte es un producto al cual se une el oligómero o primer monómero. Esto permite un lavado a fondo, a realizar cuando el oligómero unido al soporte se encuentra en el estado sólido. Ejemplos de soportes son perlas de poliestireno, zeolitas, perlas de vidrio de poros controlados, celulosa, resinas PEG o poliamida, sin que esto suponga limitación alguna. Otro ejemplo de un soporte útil es un polímero que puede existir en un estado soluble y que puede ser precipitado por adición de un disolvente adecuado con el fin de permitir que tenga lugar un lavado a fondo.

El soporte sobre el cual se efectúa la síntesis en fase sólida está funcionalizado por un espaciador (“linker”).

Un ejemplo preferido de un soporte es una resina de poliestireno-1% divinilbenceno que con frecuencia se utiliza en la síntesis de péptidos en fase sólida.

El término “unión o enganche” significa generalmente la formación de un enlace covalente y se emplea para enlaces covalentes entre cualquiera de los siguientes: puede ser el enlace covalente entre el primer monómero y el soporte, en donde este enlace se forma por medio de un linker, o bien el enlace formado entre cualquiera de los monómeros en el oligómero. El enlace entre el primer monómero y el soporte, que se forma por vía de un linker, y el enlace entre monómeros en el oligómero, puede hacer uso de cualquier funcionalidad del monómero, por ejemplo grupos funcionales en su espina dorsal o cadena lateral. En la síntesis de péptidos en fase sólida, el primer aminoácido puede ser unido al soporte por vía de linkers de tipo bencílico. El linker es una estructura molecular adecuada que se une covalentemente al soporte y que liberará el oligómero diana bajo condiciones químicas adecuadas. Con frecuencia se emplean linkers de tipo bencílico tales como éster bencílico o éster monoalcoxibencílico; sin embargo, también pueden ser considerados otros linkers. Los linkers de tipo bencílico liberan el oligómero diana bajo condiciones acidolíticas.

Por la expresión “lavado a fondo” se entiende cualquier método técnico que eliminará los subproductos o reactivos residuales de la etapa previa, por ejemplo, reactivos de acoplamiento o de desprotección. El lavado a fondo se puede efectuar de forma discontinua o según un procedimiento continuo. Ejemplos de un procedimiento continuo son el lavado a fondo del soporte con un disolvente en una columna o la eliminación de subproductos o reactivos a través de medios físicos tal como centrifugado.

En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), el péptido se ensambla sobre una perla de poliestireno como soporte. La construcción de una cadena péptida sobre un soporte en lugar de la síntesis en solución presenta ventajas evidentes: la separación de los péptidos intermedios de los reactivos solubles y disolventes se puede efectuar simplemente por filtración y lavado con los consecuentes ahorros de tiempo y trabajo respecto a las correspondientes operaciones en la síntesis en solución.

Los principios generales de la síntesis de péptidos en fase sólida son como sigue (véase Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practival Approach, de W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000, p. 41-76; Solid Phase Synthesis, A Practical Guide, de Steven A. Kates y Fernando Albericio, Marcel Dekker Inc., 2000, p. 275-330; Solid-Phase Peptide Synthesis, de Gregg B. Fields, Academic Press, 1997, páginas 3-83): generalmente, el residuo C-terminal del péptido diana se une a un soporte. También se pueden emplear las cadenas laterales de los aminoácidos para efectuar la unión al linker. La mayoría de, o preferentemente la totalidad de los grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos, deben enmascararse con grupos protectores permanentes que no son afectados por las condiciones de reacción empleadas durante el ensamblaje de la cadena péptida. El grupo αaminoácido de cada aminoácido que ha de acoplarse, se protege temporalmente. Después de la unión inicial del primer aminoácido, se separa el grupo protector temporal que enmascara al grupo α-amino. A continuación, se efectúan lavados. Se introduce entonces un exceso del segundo aminoácido, estando activado el grupo carboxi de este aminoácido para la formación de enlaces amida mediante reacción con un reactivo de acoplamiento. Después de este acoplamiento, se separan los reactivos en exceso mediante lavado. A continuación, se separa el grupo protector del terminal N del dipéptido. Tiene lugar otro lavado a fondo antes de la adición del tercer residuo de aminoácido. Este procedimiento se repite hasta que se ensambla la secuencia péptida deseada. En una etapa final, el péptido se libera del soporte.

Se requieren lavados extensivos después de cada etapa de acoplamiento y después de cada escisión de un grupo protector de α-amino, es decir, después de cada etapa de N-desprotección, con el fin de eliminar entidades químicas perjudiciales que de otro modo conducirían a errores en la secuencia en el péptido final. En particular, si todavía está presente un aminoácido activado durante la etapa de N-desprotección debido a que el lavado después del acoplamiento no ha sido efectuado adecuadamente, tendrá lugar un acoplamiento indeseado con este aminoácido y conducirá a impurezas correspondientes a la doble adición del mismo aminoácido en la secuencia péptida. Similarmente, en ciertos casos, si el lavado después de la N-desprotección y antes de la adición de un nuevo aminoácido no se efectúa adecuadamente, los reactivos de escisión permanecerán en la solución y conducirán a una doble adición de aminoácido durante la siguiente etapa de acoplamiento.

Para evitar estas secuencias de doble adición en los procedimientos clásicos, se necesitan de 6 a 10 lavados aproximadamente después de cada acoplamiento y se necesitan otros 6 a 10 lavados después de cada etapa de Ndesprotección. Esto significa que para cada aminoácido se necesitan de 12 a 20 lavados aproximadamente en un procedimiento clásico, empleando cada uno de ellos aproximadamente 10 ml de disolvente por gramo de soporte seco sin cargar (véase Peptide Synthesis Protocols, de Michael W. Pennington y Ben M. Dunn, vol. 35, Humana Press, Capítulo 1, Párrafo 3.2.1; y Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, de W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000, Tabla 2 en página 15 en combinación con p. 43). La reducción del número de etapas de lavado y de la cantidad de disolvente necesario en cada etapa de lavado individual constituiría un importante progreso en términos de ahorro de disolvente y tiempo.

Esto es aplicable no solo a las síntesis de péptidos en fase sólida sino análogamente a cualquier procedimiento de síntesis en donde se ensambla un polímero sobre un soporte. En Chem Files, Green Chemistry de Fluka, vol. 1, no. 7, 2001, páginas 1-18 se describe el uso y ventajas de sales de amonio cuaternario, líquidos iónicos, sales de fosfonio o sales de sulfonio como reactivos en catálisis de transferencia de fases y en otras reacciones químicas. Spatola A. F. et al., "Phase transfer catalysis in solid phase peptide synthesis" Int. J. Peptide Protein Res., 40 1992, 322-332 y Chen S-T. et al. "Phase-transfer Reagents as C-Tenninal Protecting Groups"... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la síntesis en fase sólida de péptidos, caracterizado porque al menos una de las etapas de lavado se efectúa en presencia de una sal (Xn+)m(Ym-)n, en donde X representa un catión, n representa la carga del catión, Y representa un anión y m representa la carga del anión, y en donde dicha sal se elige del grupo consistente en sales de amonio cuaternario, líquidos iónicos, sales de fosfonio, sales de sulfonio, sales inorgánicas o cualquier mezcla de las mismas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, para unir un aminoácido o péptido protegido en el grupo α-amino que tiene un terminal C sin proteger a otro aminoácido o péptido que está protegido por un grupo protector de α-amino y que se une a un soporte durante la síntesis de péptidos en fase sólida, que comprende las siguientes etapas:

a) escindir el grupo protector de α-amino del aminoácido o péptido unido al soporte; b) efectuar un lavado a fondo; c) añadir un aminoácido o péptido protegido en α-amino que tiene un terminal C sin proteger y acoplarlo al aminoácido o péptido que está unido al soporte y que ahora tiene un terminal N sin proteger, para formar un enlace amida; y d) efectuar otro lavado a fondo; caracterizado porque al menos en la etapa b) se añade una sal (Xn+)m(Ym-)n, que es soluble en un disolvente empleado en esta etapa, en donde X representa un catión, n representa la carga del catión, Y representa un anión y m representa la carga del anión, y en donde dicha sal se elige del grupo consistente en sales de amonio cuaternario, líquidos iónicos, sales de fosfonio, sales de sulfonio, sales inorgánicas o cualquier mezcla de las mismas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, para unir un aminoácido o péptido protegido en el grupo α-amino que tiene un terminal C sin proteger a otro aminoácido o péptido que está protegido por un grupo protector de α-amino y que se une a un soporte durante la síntesis de péptidos en fase sólida, que comprende las siguientes etapas:

a) escindir el grupo protector de α-amino del aminoácido o péptido unido al soporte; b) efectuar un lavado a fondo; c) añadir un aminoácido o péptido protegido en α-amino que tiene un terminal C sin proteger y acoplarlo al aminoácido o péptido que está unido al soporte y que ahora tiene un terminal N sin proteger, para formar un enlace amida; y d) efectuar otro lavado a fondo; caracterizado porque al menos en la etapa c) se añade una sal (Xn+)m(Ym-)n, que es soluble en un disolvente empleado en esta etapa, en donde X representa un catión, n representa la carga del catión, Y representa un anión y m representa la carga del anión, y en donde dicha sal se elige del grupo consistente en sales de amonio cuaternario, líquidos iónicos, sales de fosfonio, sales de sulfonio, sales inorgánicas o cualquier mezcla de las mismas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, para unir un aminoácido o péptido protegido en el grupo α-amino que tiene un terminal C sin proteger a otro aminoácido o péptido que está protegido por un grupo protector de α-amino y que se une a un soporte durante la síntesis de péptidos en fase sólida, que comprende las siguientes etapas:

a) escindir el grupo protector de α-amino del aminoácido o péptido unido al soporte; b) efectuar un lavado a fondo; c) añadir un aminoácido o péptido protegido en α-amino que tiene un terminal C sin proteger y acoplarlo al aminoácido o péptido que está unido al soporte y que ahora tiene un terminal N sin proteger, para formar un enlace amida; y d) efectuar otro lavado a fondo; caracterizado porque al menos en la etapa d) se añade una sal (Xn+)m(Ym-)n, que es soluble en un disolvente empleado en esta etapa, en donde X representa un catión, n representa la carga del catión, Y representa un anión y m representa la carga del anión, y en donde dicha sal se elige del grupo consistente en sales de amonio cuaternario, líquidos iónicos, sales de fosfonio, sales de sulfonio, sales inorgánicas o cualquier mezcla de las mismas.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde (Ym-)n se elige del grupo consistente en fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, hidróxido, carbonato, hidrogenocarbonato, nitrato, fosfato, hidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, tetrafluorborato, hexafluorfosfato, acetato, carboxilatos, cianuros, isocianatos, tetraalquilboratos, tetraarilboratos, trifluoracetato, tosilato, mesilato o cualquier mezcla de los mismos, en donde Y representa un anión, m representa la carga del anión y n representa la carga del catión.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sal de amonio cuaternario se elige entre hidróxido de benciltrimetilamonio, cloruro de benciltrimetilamonio o carbonato de benciltrimetilamonio, la sal de fosfonio es bromuro de tetrabutilfosfonio y la sal de sulfonio es tetrafluorborato de trietilsulfonio.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la sal añadida en la etapa b), c) o d)

también se añade en una o más de las otras etapas.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el grupo protector de α-amino es Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) o Nsc (p-nitrofenilsulfoniletoxi-carbonato) o cualquiera de otros grupos protectores escindibles por bases.

5 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el grupo protector de α-amino es Boc (terc-butoxicarbonilo), Trt (tritilo), Bpoc (2-p-bifenilisopropiloxicarbonilo) o cualquier otro grupo protector escindible por ácido.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el grupo protector de α-amino se elige de manera que no se requiera ningún tratamiento con ácido o con base para su escisión.

11. Procedimiento para sintetizar un péptido, que comprende:

a') unir un primer aminoácido o péptido, que tiene un grupo protector de α-amino, por vía de su terminal C sobre un soporte funcionalizado; b') efectuar el procedimiento como el descrito anteriormente con el siguiente aminoácido o péptido previsto en la secuencia; c') repetir la etapa b') con los aminoácidos o péptidos adecuados hasta que se consigue la secuencia deseada; y d') escindir el péptido ensamblado del soporte por medio de un método adecuado.

12. Uso de una sal (Xn+)m(Ym-)n en los procedimientos de la reivindicación 1 o 3 para mejorar el lavado de la resina peptídica, en donde X representa un catión, n representa la carga del catión, Y representa un anión y m representa la carga del anión.

13. Uso según la reivindicación 12 para mejorar la eliminación del exceso de aminoácidos o reactivos de escisión.