PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE CONTROL DE PARTÍCULAS TALES COMO MICROORGANISMOS Y CÉLULAS.

Procedimiento para la preparación automática de muestras que contienen un número predeterminado de células o microorganismos deseados que comprende:

proporcionar un separador de partículas bajo control de software; proporcionar un aparato de recolección que presenta un receptáculo o superficie que retiene las células o los microorganismos, en el que el separador de partículas y el aparato de recolección se encuentran en comunicación electrónica mediante un circuito de ratón de ordenador modificado que presenta un interruptor de botón puenteado mediante un optoacoplador; separar un número predeterminado de las células o microorganismos deseados mediante el separador de partículas; y distribuir el número predeterminado de células o microorganismos mediante el separador de partículas en el receptáculo o en la superficie del aparato de recolección de acuerdo con una señal del aparato de recolección; en el que la señal se envía desde el aparto de recolección al separador de partículas mediante el circuito de ratón de ordenador modificado que activa el software que controla el separador de partículas a través de un botón de función de adquisición del software de control del separador de partículas de manera que cuando se ha recibido una señal el número predeterminado de células o microorganismos se administra dentro del receptáculo o sobre la superficie que está colocado durante el tiempo suficiente para recoger las células o los microorganismos mediante el aparato recolector, y en el que a continuación de la recolección de las células o los microorganismos el aparato de recolección avanza y coloca un receptáculo o superficie posterior para recibir las células o los microorganismos posteriores, señalando el aparato recolector a continuación el separador de partículas mediante el circuido de ratón de ordenador modificado para iniciar la distribución de otro número predeterminado de células o microorganismos, en el que el separador de partículas es un citómetro de flujo

La presente invención se refiere a un procedimiento destinado a la preparación de muestras que comprenden números predeterminados de células o microorganismos tales como bacterias, protozoos, levaduras, hongos, esporas, polen y virus. 5

Nota: La bibliografía se recoge al final de la descripción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existen múltiples situaciones en las que se miden microorganismos en sólidos o líquidos. Muestras tales como las de agua, aire, alimentos, bebidas y muestras clínicas se ensayan rutinariamente con múltiples procedimientos microbiológicos. Es esencial que dichos ensayos se realicen con precisión de modo fiable y que los resultados sean 10 comparables entre muestras y entre laboratorios.

Los procedimientos de ensayo utilizados oscilan ampliamente pero implican en su totalidad algunas manipulaciones de la muestra. Los ejemplos comprenden flotación, pipeteo, centrifugación, filtración u homogenización. Se pueden producir pérdidas de la muestra y las pérdidas de las células o microorganismos durante tales manipulaciones. Estas pérdidas oscilarán entre diferentes tipos de muestras. Algunos de los procedimientos pueden también implicar múltiples 15 pretratamientos tales como calentamiento, congelación, agitación, mezclado o ajustes del pH. Estos tratamientos también pueden causar pérdidas de células o microorganismos. Todos los procedimientos de ensayo implican un procedimiento de detección y también pueden implicar la enumeración de las partículas recobradas. Esto puede ser un procedimiento sencillo tal como el contado de colonias en una placa de agar o puede ser un procedimiento analítico complejo tal como la citometría de flujo o la separación inmunomagnética. Todos estos procedimientos de detección y 20 enumeración tendrán imprecisiones que afectarán a los resultados del ensayo.

El control de calidad (QC) se realiza de modo rutinario con el fin de comprobar la precisión del procedimiento de ensayo y para determinar las pérdidas de células o microorganismos que ocurren durante el procedimiento de ensayo. El procedimiento de QC generalmente implica el análisis de una muestra que ha sido sembrada con células o microorganismos específicos. El número de células o microorganismos que se sembró en la muestra se compara a 25 continuación con el número detectado.

El procedimiento de QC depende de la disponibilidad de muestras de control que comprenden números conocidos de células o microorganismos. Estas muestras de control deben ser fiables y los números en cada muestra deben ser precisos. Tales muestras de control son difíciles de preparar, frecuentemente no son estables y no están ampliamente disponibles. 30

El agua se ensaya rutinariamente para determinar la presencia de Cryptosporidium y Giardia. El procedimiento de ensayo implica numerosos procedimientos en los que los microorganismos se pueden perder (Vesey et al., 1994a). Es, por consiguiente, importante realizar un control de calidad riguroso con el fin de seguir el comportamiento de la metodología. El control de calidad puede implicar el análisis de un estándar que comprende un número conocido de quistes y oocistos. La preparación de los estándares utilizando procedimientos convencionales tales como el pipeteo 35 producen preparaciones imprecisas (Reynolds et al., 1999). Además, las preparaciones no son estables. Con el tiempo se produce el deterioro y la agregación de los microorganismos.

La citometría de flujo ha demostrado ser de utilidad en la preparación precisa de material de control (Reynolds et al., 1999), sin embargo, el procedimiento es tedioso y largo y por consiguiente, no es adecuado para la producción a gran escala. 40

Los sistemas de enfriamiento del agua y de distribución de agua se ensayan continuamente para determinar la presencia de Legionella. El procedimiento de ensayo implica la concentración de bacterias en la muestra de agua mediante centrifugación o filtración y la detección de la bacteria Legionella mediante un procedimiento de cultivo, procedimientos inmunológicos o procedimientos moleculares. La utilización del procedimiento de cultivo es limitada debido a que se requieren entre 5 y 10 días para obtener resultados. 45

Es esencial que la calidad de los procedimientos inmunológicos y moleculares sea estrictamente controlada. Debido los dos procedimientos son susceptibles de producir resultados negativos falsos. El control de calidad implica el análisis de un estándar que comprende un número conocido de células de Legionella. Sin embargo, los estándares precisos son difíciles de preparar y no son estables. Las preparaciones se pueden realizar utilizando citometría de flujo con el fin de analizar la dispersión de luz por las células y clasificar las células. Si se han de clasificar células vivas de Legionella se 50 necesita un procedimiento para producir alícuotas que no produzca aerosoles, tal como un dispersor piezo capilar, con el fin de evitar los riesgos biológicos.

Por consiguiente existe una necesidad de un procedimiento automático, preciso, conveniente y coste-efectivo para producir muestra que comprenden números de células o microorganismos predeterminados.

La presente invención permite la preparación automática de muestras que comprenden números predeterminados de células o microorganismos. Estas muestras que comprenden los números conocidos de células o microorganismos se pueden irradiar con rayos gamma o tratar de otro modo con el fin de prolongar la estabilidad y la vida de almacenamiento de la muestra. Un porcentaje de las muestras se puede ensayar con el fin de determinar el número de células o microorganismos en cada muestra. 5

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento destinado a la preparación automática de muestras que comprenden números predeterminados de las células o microorganismos, procedimiento que comprende proporcionar una muestra de células o microorganismos y separar un número predeterminado de las células o microorganismos deseados mediante un procedimiento de separación de partículas, distribuyendo el número 10 predeterminado de células o microorganismos en un receptáculo o en una superficie de acuerdo con una instrucción de separación, estando el receptáculo o la superficie colocado en posición por los medios de recolección para recibir las células o microorganismos dispensados, que se caracteriza por que la instrucción de clasificación de los medios que distribuyen partículas activas los medios de clasificación de tal modo que cuando se ha accionado una instrucción de separación para administrar un número predeterminado de células o microorganismos en un receptáculo o en una 15 superficie que está situada con precisión durante el tiempo suficiente para recolectar todas las células o microorganismos clasificados, los medios de recolección avanzan y colocan una siguiente superficie o receptáculo para recibir células o microorganismos, señalando dichos medios de recolección señalando por consiguiente a los medios de separación de partículas para que comience la siguiente instrucción de clasificación.

Las células o microorganismos son partículas pequeñas, en particular las utilizadas para el control de calidad y 20 comprenden células animales o vegetales, bacterias, protozoos, levaduras, hongos, esporas, polen y virus.

Los medios de separación de partículas son preferentemente medios de separación automáticos que manejan líquidos tales como un citómetro de flujo, un aparato de separación de partículas Coulter, o cualquier otros medios que separan células o microorganismos basados en las propiedades químicas, físicas, biológicas , fluorescentes u otras.

Un ejemplo particular de medios de separación de partículas que se pueden utilizar para dispensar y analizar células o 25 microorganismos es la citometría de flujo. La citometría de flujo se puede utilizar con el fin de definir las propiedades de dispersión de luz de las células o microorganismos (Shapiro, 1996; Vesey et al., 1994b). La citometría de flujo permite preparar una población predeterminada de células o microorganismos. Un citómetro de flujo se puede ajustar para clasificar un número definido de células o microorganismos utilizando las propiedades de dispersión de luz con el fin de distinguir las células o microorganismos de las partículas contaminantes. Las células o microorganismos clasificados se 30 pueden a continuación recoger en...

1. Procedimiento para la preparación automática de muestras que contienen un número predeterminado de células o microorganismos deseados que comprende:

proporcionar un separador de partículas bajo control de software; 5

proporcionar un aparato de recolección que presenta un receptáculo o superficie que retiene las células o los microorganismos, en el que el separador de partículas y el aparato de recolección se encuentran en comunicación electrónica mediante un circuito de ratón de ordenador modificado que presenta un interruptor de botón puenteado mediante un optoacoplador;

separar un número predeterminado de las células o microorganismos deseados mediante el separador de partículas; y 10

distribuir el número predeterminado de células o microorganismos mediante el separador de partículas en el receptáculo o en la superficie del aparato de recolección de acuerdo con una señal del aparato de recolección;

en el que la señal se envía desde el aparto de recolección al separador de partículas mediante el circuito de ratón de ordenador modificado que activa el software que controla el separador de partículas a través de un botón de función de adquisición del software de control del separador de partículas de manera que cuando se ha recibido una señal el 15 número predeterminado de células o microorganismos se administra dentro del receptáculo o sobre la superficie que está colocado durante el tiempo suficiente para recoger las células o los microorganismos mediante el aparato recolector, y en el que a continuación de la recolección de las células o los microorganismos el aparato de recolección avanza y coloca un receptáculo o superficie posterior para recibir las células o los microorganismos posteriores, señalando el aparato recolector a continuación el separador de partículas mediante el circuido de ratón de ordenador 20 modificado para iniciar la distribución de otro número predeterminado de células o microorganismos,

en el que el separador de partículas es un citómetro de flujo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células o los microorganismos se seleccionan de entre células, bacterias, protozoos, levaduras, hongos, esporas, polen o virus.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que las células son animales o vegetales. 25

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el separador de partículas es un separador de líquidos automático seleccionado de entre el grupo constituido por citómetro de flujo, aparato Coulter para la separación de partículas, y un separador óptico de partículas.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aparato recolector es un colector de fracciones. 30

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células o los microorganismos se irradian con radiación gamma o radiación U.V.

7. Procedimiento para la preparación automática de muestras que contienen números predeterminados de los microorganismos o las células deseados que comprende:

separar los microorganismos o las células utilizando un citómetro de flujo bajo el control de software; 35

distribuir mediante el citómetro de flujo números predeterminados de microorganismos o células separados dentro de un receptáculo o sobre una superficie que puede retener los microorganismos o células colocados en una zona de recolección mediante un colector de fracciones durante el tiempo suficiente para recoger los microorganismos o las células;

mover automáticamente el receptáculo o la superficie fuera de la zona de recolección y colocar otro receptáculo o 40 superficie en la zona de recolección;

señalar automáticamente el citómetro de flujo para dispensar los microorganismos o las células; y

repetir automáticamente la distribución de los microorganismos o las células hasta que se ha preparado el número de muestras requerido, en el que la señalación automática al citómetro de flujo para distribuir los microorganismos o las células es realizada por el colector de fracciones cada vez que el colector de fracciones coloca un nuevo tubo en la zona 45 de recolección mediante el envío de una señal a través del circuito de ratón de ordenador modificado en el que un interruptor de botón de ratón está puenteado y reemplazado por un optoacoplador que activa el software que controla el citómetro de flujo mediante un botón para la función de adquisición del software de control del citómetro de flujo.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende además:

realizar un análisis en un porcentaje de las muestras con el fin de confirmar el número de microorganismos o células en las muestras.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, que comprende además:

pesar una muestra como procedimiento adicional de control de calidad.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la muestra se tiñe con un marcador para 5 diferenciar los microorganismos o células diana de las partículas contaminantes contenidas en la muestra.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la muestra se tiñe con un marcador de anticuerpos fluorescente.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que los microorganismos o las células clasificados que forman la muestra de control se irradian mediante radiación gamma o radiación UV.

13. Sistema para la preparación automática de muestras de control que contienen números deseados de 10 microorganismos o células que comprende:

un citómetro de flujo bajo el control de software; y

un colector de fracciones que presenta una zona de recolección que aloja una pluralidad de receptáculos o superficies para la retención de microorganismos o células, en el que el citómetro de flujo y el colector de fracciones se encuentran en comunicación electrónica mediante un circuito de ratón de ordenador modificado que presenta un interruptor de 15 botón de ratón puenteado mediante un optoacoplador; el circuito de ratón de ordenador modificado está adaptado para pasar una señal desde el colector de fracciones al citómetro de flujo que activa el software que controla una instrucción de clasificación para el citómetro de flujo a través de un botón para la función de adquisición del software de control del citómetro de flujo;

en el que la instrucción de clasificación enviada desde el colector de fracciones al citómetro de flujo mediante el circuito 20 del ratón modificado activa el software que controla el citómetro de flujo mediante un botón de función de adquisición en el software de control del citómetro de manera que cuando se ha enviado una instrucción el número predeterminado de microorganismos o células se administra en el receptáculo o sobre la superficie que se coloca durante el tiempo suficiente para recoger los microorganismos o células por el colector de fracciones,

a continuación de la recolección el colector de fracciones avanza y coloca un receptáculo o superficie posterior con el fin 25 de recibir los microorganismos o células posteriores, señalando el colector de fracciones a continuación al citómetro de flujo a través del circuito de ratón modificado para que inicie otra instrucción de clasificación.