METODO Y KIT PARA LA DETECCION E IDENTIFICACION DE ESTIRPES DE ESCHERICHIA COLI DIARREAGENICOS.

Método y kit para la detección e identificación de estirpes de Escherichia coli diarreagénicos.



La presente invención consiste en un método y un kit para la detección e identificación y genotipado de estirpes patógenas de Escherichia coli causantes de diarrea (E. coli diarreagénicos), y en particular E. coli productores de verotoxinas (E. coli verotoxigénicos). El cuerpo de la invención consta de un grupo de sondas moleculares para la identificación de estirpes de E. coli verotoxigénicas y otras estirpes de E. coli diarreagénicas. Dichas sondas corresponden a secuencias específicas de variantes genéticas de uno o más genes de la isla de patogenicidad LEE. La invención aporta sondas específicas para al menos 25 variantes del gen de intiminas (eae), 4 del gen tir, 4 del gen espA, 3 de espB y 3 de espD. Dichas sondas van situadas en forma de matriz ordenada (microarray) sobre superficies sólidas (biochip), o bien son suministradas para realizar amplificaciones específicas por PCR. Lainvención aporta ADN control para cada una de las estirpes

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200503220.

Solicitante: INSTITUTO NACIONAL DE TECNICA AEROESPACIAL "ESTEBAN TERRADAS".
UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MADRID.

Inventor/es: BRIONES LLORENTE,CARLOS, PARRO GARCIA,VICTOR, MORENO PAZ, MERCEDES, GARRIDO GARCIA,PATRICIA, BLANCO ALVAREZ,JORGE, BLANCO ALVAREZ,MIGUEL, BLANCO ALVAREZ,JESUS EULOGIO.

Fecha de Solicitud: 28 de Diciembre de 2005.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 30 de Abril de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68B10A

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Fragmento de la descripción:

Método y kit para la detección e identificación de estirpes de Escherichia coli diarreagénicos.

La invención pertenece al campo de los biosensores de microorganismos basados en el reconocimiento molecular específico entre ácidos nucleicos, y concretamente en el campo de los microarrays o biochips de ADN.

Estado de la técnica Escherichia coli Diarreagénicos (ECDI)

E. coli es la especie predominante de la flora normal aerobia y anaerobia facultativa del tubo digestivo en la mayor parte de los mamíferos, y se elimina por las heces al exterior. Se puede encontrar en el medio ambiente ya que es capaz de sobrevivir durante cierto tiempo en el agua y los alimentos, de manera que su aislamiento es un indicador de contaminación fecal reciente.

Algunas cepas de E. coli son patógenas y pueden producir infecciones entéricas (diarrea, disentería, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico y enfermedad de los edemas) o extraintestinales (infecciones del tracto urinario, bacteriemias o septicemias, meningitis, peritonitis, mastitis, e infecciones pulmonares y de heridas). E. coli provoca en seres humanos del orden de 630 millones de casos de diarrea en el mundo y aproximadamente 775.000 muertes al año, afectando fundamentalmente a la población infantil del tercer mundo. Además, es el patógeno oportunista más frecuentemente asociado con infecciones urinarias y septicemias en seres humanos. En animales domésticos las colibacilosis son muy frecuentes, incidiendo esencialmente en animales de pocos días de edad y en recién destetados, y ocasionan importantes pérdidas económicas en las explotaciones de ganado bovino, porcino y ovino, así como en la cría intensiva de aves y conejos. Mientras que en terneros, lechones, corderos y gazapos E. coli suele producir diarrea, en aves provoca fundamentalmente infecciones respiratorias (aerosaculitis) y septicemias. Además E. coli puede causar en rumiantes, ganado porcino, perros y gatos colisepticemias en neonatos hipoganmaglobulinémicos, infecciones urinarias y mamitis.

Aunque las cepas de E. coli que causan infecciones en seres humanos y animales pueden compartir determinados factores de virulencia, en general presentan diferentes serotipos y poseen adhesinas específicas que son responsables de su especificidad de huésped. Por lo tanto, las cepas de E. coli patógenas para seres humanos no suelen producir infecciones en animales y viceversa. No obstante, se ha comprobado que los animales pueden ser un reservorio de E. coli enteropatógenos para las personas. Así, los E. coli verotoxigénicos (ECVT) que causan colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico en humanos, forman parte de la flora normal intestinal del ganado bovino y ovino donde se comportan, en la mayor parte de los casos, como comensales. La ingestión de hamburguesas o de leche contaminada ha provocado en los últimos anos numerosos brotes epidémicos en países desarrollados. También se han detectado E. coli uropatogénicos que pueden causar infección cruzada en seres humanos, perros y gatos.

Los E. coli patógenos se han englobado en diferentes grupos o categorías: E. coli enteropatogénicos (ECEP), E. coli enterotoxigénicos (ECET), E. coli enteroinvasivos (ECEI), E. coli verotoxigénicos (ECVT) o enterohemorrágicos (ECEH), E. coli enteroagregativos (ECEA), E. coli con adherencia difusa (ECAD), E. coli uropatogénicos y E. colt bacteriémicos o septicémicos. Las cepas de estos grupos presentan mecanismos de patogénesis específicos, serotipos distintos y producen infecciones y síndromes diferentes (3, 4, 5).

Factores de virulencia de E. coli diarreagénicos humanos

E. coli Verotoxigénicos (ECVT)

Los ECVT, y muy especialmente los enterohemorrágicos altamente virulentos del serotipo O157:H7, son importantes patógenos emergentes que causan patologías muy severas en seres humanos: colitis hemorrágica (CH) y el síndrome urémico/hemolítico (SUH) (1, 8, 6, 9). Los rumiantes constituyen el principal reservorio de este tipo de microorganismos, siendo la carne picada, las hamburguesas y los productos lácteos sin pasteurizar los principales vehículos de transmisión (2, 14). El ECVT del serotipo O157:H7 ha provocado en los últimos años un gran número de brotes de CH, la mayoría de los cuales han tenido lugar en los países anglosajones (Reino Unido, EE.UU. y Canadá) y en Japón. En España los ECVT del serotipo O157:H7 han provocado siete brotes. El brote que afectó a un mayor número de individuos tuvo lugar en el ano 2000 en cinco centros escolares situados en la provincia de Barcelona. La toxiinfección alimentaria afectó a 158 personas (la mayoría niños menores de cinco anos), de las cuales seis desarrollaron el SUH (15).

Las verotoxinas (Shiga toxins) son potentes citotoxinas que destruyen las células Vero y están relacionadas estructural e inmunológicamente con la toxina Shiga producida por Shigella dysenteriae tipo 1. Existen dos tipos de verotoxinas, VT1 (Stx1) y VT2 (Stx2), y diversas variantes de ambas toxinas (VT1, VT1c, VT1d, VT2, VT2c, VT2d, VT2e, VT2f, VT2g) (16, 17, 19). Establecer las variedades de VT resulta importante, ya que determinadas variedades se ha relacionado con una mayor virulencia para humanos, y otras variedades se han detectado exclusivamente en cepas de origen animal. Todas las verotoxinas se encuentran codificadas en el genoma de profagos integrados en el cromosoma bacteriano (20). Los ECVT, además de producir verotoxinas, presentan factores de virulencia adicionales que incrementan su poder patógeno. Así, los ECVT se unen al epitelio del intestino grueso a través de unas fimbrias codificadas en el plásmido pO157 (60 MDa) y posteriormente barren el microvilli intestinal por la acción de unas proteínas presentes en su membrana externa que están controladas por el gen cromosómico eae y reciben el nombre de intiminas (5).

E. coli Enteropatogénicos (ECEP) típicos y atípicos

En los países en vías de desarrollo los ECEP son considerados como una de las principales causas de diarrea infantil, predominado especialmente los serotipos O111:H2 y O119:H6. Los ECEP provocan una diarrea acuosa con dolores abdominales y fiebre moderada (5, 7).

Actualmente se conocen bastante bien los mecanismos de patogénesis de los ECEP típicos. Poseen una adhesina BFP (bundle-forming pilus) codificada en el plásmido EAF (EPEC adherence factor). Dicha adhesina es responsable de la adhesión a distancia de la bacteria al enterocito y de la adhesión localizada a células HEp-2. Presentan también la isla de patogenicidad LEE (locus of enterocyte effacement) con los genes: eae, tir, esp y sep. El gen eae codifica una proteína de la membrana externa denominada intimina que es responsable de la adhesión íntima de la bacteria al enterocito. El gen tir (translocated intimin receptor) codifica el receptor celular al que se une la intimina. La bacteria, después de unirse a distancia al enterocito mediante las fimbria BFP, excreta el recerptor Tir que se fija al enterocito y a continuación la bacteria se une intimamente al enterocito al fijarse la intimina al receptor Tir. Los genes esp (E. coli secreted proteins) codifican proteínas necesarias para la producción de la lesión de adhesión y borrado (attaching and effacing) del microvilli intestinal y la condensación de la actina del citoesqueleto celular, que provoca la aparición de un pedestal en forma de copa sobre el que descansa la bacteria. Los genes sep (secretion of E. coli proteins) codifican las proteínas que constituyen un sistema de secreción de proteínas tipo III (5). Los ECEP típicos generalmente presentan las intiminas alfa 1, beta 2, delta/kappa y my. Los ECEP atípicos, al igual que los ECEP típicos presentan el gen eae, pero carecen del gen bfp presente en el plásmido EAF de los ECEP típicos.

E. coli Enterotoxigénicos (ECET)

Los ECET son considerados en la actualidad, junto con los E. coli enteropatogénicos (ECEP) y los rotavirus, los patógenos que con mayor frecuencia causan gastroenteritis infantil, diarrea colérica y diarrea del viajero en países con condiciones higiénico/sanitarias deficientes. El agua y los alimentos contaminados han sido implicados como vehículos en la mayoría de los brotes. Los ECET sintetizan las enterotoxinas LT y/ó STa y poseen los factores de colonización...

 


Reivindicaciones:

1. Método para la detección e identificación de diferentes estirpes de Escherichia coli diarreagénicas caracterizado porque comprende la determinación simultánea de los genes de la isla de patogenicidad LEE eae, espA, espB, espD, tir, genes stx1, stx2, bfp, elt, est, inv mediante los siguientes pasos:

a) Extracción de ADN de una muestra

b) Amplificación del ADN extraído en la etapa a), con los cebadores identificados con las secuencias SEQ ID NO: 187-350

c) Hibridación de los fragmentos de ADN amplificados en la etapa b) con las sondas identificadas con las secuencias SEQ ID NO: 1-186

d) Interpretación de los resultados.

2. Método según la reivindicación 1, donde la amplificación de la etapa b) se realiza mediante PCR.

3. Método según la reivindicación 1, donde las sondas identificadas con las secuencias SEQ ID NO: 1-186 están modificadas en el extremo 5'amino con una cola de 10 timidinas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las sondas están inmovilizadas en un soporte sólido en formato bidimensional, tridimensional, microesferas, nanoesferas, gel, o coloide.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde después de la etapa b) de amplificación y previo a la etapa c) de hibridación hay una etapa de marcaje de los fragmentos de ADN amplificados.

6. Método según la reivindicación 5 donde el marcaje de los fragmentos de ADN amplificados se realiza por medio de métodos enzimáticos o químicos.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la interpretación de los resultados se realiza mediante métodos espectrométricos, resonancia de plasmon en superficie, o escaneado y captura de imagen.

8. Kit para la detección e identificación de diferentes estirpes de Escherichia coli diarreagénicos según el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:

a) Medios para eI aislamiento de ADN total bacteriano b) Al menos un tipo de ADN de alguna estirpe de E. coli diarreagénico como control. c)Medios para la amplificación de ADN total bacteriano d) oligonucleótidos identificados con las secuencias SEC. ID. NO. 187-SEC. ID. NO. 350 e) Microarrays con las sondas identificadas con las secuencias SEC. ID. NO. 1-SEC. ID. NO. 186. f) Medios para la amplificación y marcaje simultáneos de una parte o de todo el ADN bacteriano. g) Medios para el marcaje y purificación de ADN h) Medios para la hibridación del ADN con los microarrays i) Medios para la interpretación de los resultados.

 

Patentes similares o relacionadas:

METODO IN VITRO PARA EL PRONOSTICO O PREDICCION DE LA RESPUESTA POR PARTE DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE AL TRATAMIENTO CON AGENTES QUE RECONOCEN EL RECEPTOR DE MEMBRANA CD20 DE LOS LINFOCITOS B, del 28 de Noviembre de 2011, de FUNDACIO INSTITUT DE RECERCA DE L'HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON: Método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta por parte de pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con agentes que reconocen el receptor […]

TECNOLOGIA DE PROCESADORES GÉNICOS PARA DETERMINAR GENES DE MEMORIA, del 21 de Julio de 2011, de COLD SPRING HARBOR LABORATORY F. Hoffmann-La Roche AG EMORY UNIVERSITY: Un procedimiento que identifica un gen o genes candidatos implicados en la memoria dependiente de la transcripción de aprendizaje asociativo que comprende […]

MÉTODO DE GUÍA DE ONDAS ÓPTICA PARA DETECTAR ACONTECIMIENTOS DE UNIÓN ESPECÍFICA MEDIANTE DIFUSIÓN DE LA LUZ, del 11 de Mayo de 2011, de ABBOTT LABORATORIES: Un procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de segmento de ácido nucleico desconocido o para distinguir dos secuencias de nucleótidos estrechamente […]

GENES DE CONTROL PARA LA NORMALIZACIÓN DE DATOS DE ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA, del 6 de Mayo de 2011, de SIRS-LAB GMBH: Conjunto de genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto […]

MÉTODO DE DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO Y SUSTRATO PARA DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO, del 6 de Abril de 2011, de HITACHI PLANT TECHNOLOGIES, LTD: Método de detección de secuencias de ácido nucleico para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana particular que va a detectarse […]

APARATO Y PROCEDIMIENTO PARA LA SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS, del 7 de Diciembre de 2010, de 454 LIFE SCIENCES CORPORATION: Matriz para secuenciar un ácido nucleico, que comprende: una oblea cavitada de fibras ópticas formadas a partir de un haz de una pluralidad de fibras ópticas […]

METODOS Y PRODUCTOS PARA GENOTIPADO IN VITRO, del 30 de Septiembre de 2010, de PROGENIKA BIOPHARMA, S.A.: El método de genotipado se basa en la combinación de un diseño experimental de DNA-chips de genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de procesamiento e interpretación […]

SISTEMA DE CLASIFICACION E INMOVILIZACION PARA ACIDOS NUCLEICOS UTILIZANDO SISTEMAS DE FIJACION SINTETICOS, del 14 de Septiembre de 2010, de NANOGEN RECOGNOMICS GMBH: Un método para modificar enzimáticamente un ácido nucleico diana, por reacción de ligación independiente del molde, o ligación de extremos romos o por PCR, […]

Otras patentes de la CIP C12Q1/68