GENERACION DE MUESTRAS PARA GENOTIPAR MEDIANTE ESPECTROMETRIA DE MASAS.

Método para el genotipado de polimorfismos de un nucleótido único (SNP) mediante espectrometría de masas,

que comprende las etapas siguientes:

a. reducir la complejidad de la muestra de ADN genómico para obtener un representación amplia del genoma mediante PCR Alu o PCR de cebadores oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR),

b. generar un(os) producto(s) específico(s) de alelo sobre los productos generados en la etapa a., en el que la generación del (de los) producto(s) específico(s) de alelo en la etapa b. se lleva a cabo mediante por lo menos un método que utiliza un(os) oligonucleótido(s) específico(s) de alelo,

c. analizar por espectrometría de masas los productos generados en la etapa b, en el que el análisis de espectrometría de masas en la etapa c. se lleva a cabo sobre los productos generados en la etapa b. sin purificación ni separación de la mezcla de reacción

Generación de muestras para genotipar mediante espectrometría de masas.

La invención se refiere a un método universal para preparar muestras de ADN para el genotipado de polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP), deleciones e inserciones, mediante espectrometría de masas. El método de la invención permite generar muestras de una manera que permite someter a ensayo una amplia representación del genoma del individuo, y analizar estas muestras mediante espectrometría de masas sin necesidad de una etapa de purificación.

El más importante de los proyectos genoma, la secuencia completa del genoma humano, finalizará en los próximos años. Este proyecto revelará la secuencia completa de los 3.000 millones de bases y las posiciones relativas de la totalidad de los estimados 100.000 genes en este genoma. Disponer de esta secuencia abre posibilidades ilimitadas para dilucidar la función génica y la interacción de diferentes genes. También permitirá la implementación de farmacogenética y farmacogenómica. La farmacogenética y la farmacogenómica presentan como objetivo el uso dirigido de medicación en dependencia con el genotipo de un individuo, y por lo tanto, la drástica mejora de la eficiencia de los fármacos. Una etapa intermedia necesaria a lo anterior es determinar la variabilidad de los diferentes individuos a nivel genómico. Esto se consigue determinando diferentes marcadores y después utilizándolos para el genotipado.

En la actualidad se utilizan dos tipos de marcadores para el genotipado: microsatélites y polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP). Los microsatélites son marcadores altamente polimórficos en los que diferentes alelos están constituidos por un número diferente de elementos de secuencia repetitivos entre regiones flanqueantes conservadas. De promedio, se encuentra un microsatélite cada 100.000 bases. Un mapa completo de los marcadores microsatélites en el genoma humano ha sido presentado por Généthon (Dib et al., Nature 380:152-4, 1996). Los microsatélites se genotipan a partir de la determinación de los tamaños de los productos de PCR generados a lo largo de la región repetitiva en geles. Los sistemas más ampliamente utilizados se basan en la utilización de ADN marcado fluorescentemente y su detección en secuenciadores fluorescentes. Se encuentran menos SNP en el dominio público. El consorcio SNP está estableciendo un mapa de los SNP de 300.000 SNP (Science 284:406-407, 1999).

Para el genotipado de los SNP, el experto en la materia dispone de unos cuantos métodos, todos con ventajas y desventajas.

Algunos de dichos métodos se basan en la detección en gel, por ejemplo el ensayo de la ligasa de oligonucleótidos (OLA), y por ello sólo permiten aplicaciones de rendimiento intermedio.

Otros métodos se basan en la hibridación únicamente, que no es tan discriminante y resulta difícil de ajustar para obtener la elevada astringencia necesaria (matrices de oligonucleótidos, chips de ADN). Aunque los chips de ADN resultan muy adecuados para el genotipado simultáneo de un gran número de genotipos en una región muy limitada del genoma y en un número supervisable de individuos, el problema principal observado al utilizar estos métodos es la dificultad para optimizar las condiciones de la hibridación (en particular para la astringencia).

Se han utilizado enfoques de extensión de cebadores y de detección mediante fluorescencia. Su ventaja es la fácil detección de la emisión en un lector de tipo ELISA. La limitación de estos métodos es el limitado número de pigmentos fluorescentes disponible, que a su vez limita el número de muestras que puede analizarse simultáneamente.

Varios métodos utilizan la detección con un espectrómetro de masas, debido a que la espectrometría de masas permite potencialmente un rendimiento muy alto y simultáneamente proporciona información adicional a partir de la masa absoluta. En aplicaciones en las que se mide un producto específico de un alelo, ésta es información directa y por lo tanto muy sólida. Sin embargo, aunque la espectrometría de masas presenta un potencial muy alto para el genotipado de un gran número de muestras, la desventaja principal que presentan actualmente los usuarios es la necesidad de purificar las muestras generadas antes del análisis mismo.

De hecho, recientemente se ha presentado un método denominado "ensayo Invader" (T. Griffin y L.M. Smith, Proceedings of the ASMS, 1998, patentes WO nº 98/23774 y US nº 5.843.669). En este procedimiento se aplican dos oligonucleótidos que cubren un polimorfismo conocido. Un oligonucleótido cubre la secuencia de manera que su extremo 3' se encuentre sobre la posición del polimorfismo. Para el ensayo se utilizan dos oligonucleótidos con la secuencia que continúa en el lado 3' de la posición del polimorfismo. En el lado 5' del polimorfismo se cubren los diferentes alelos y después se continúa con cualquier secuencia de bases. Dichos dos oligonucleótidos se hibridan con ADN genómico. Mediante la utilización de una endonucleasa estructuralmente específica, se recorta el extremo 5'-protuberante del oligonucleótido 3' en el caso de que exista apareamiento con el alelo del polimorfismo. El fragmento escindido se utiliza para la caracterización. Ésta puede realizarse mediante análisis directo del fragmento escindido mediante, por ejemplo, espectrometría de masas, o uniendo pigmentos fluorescentes al oligonucleótido y observando el desarrollo de la extinción de la fluorescencia. La desventaja de esta detección mediante espectrometría de masas es que la sensibilidad de detección es reducida y que los fragmentos escindidos deben purificarse debido a que el análisis del ADN nativo es muy sensible a las impurezas.

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) permite el análisis de espectrometría de masas de moléculas biológicas (Karas, M. e Hillenkamp, F., Anal. Chem. 60:2299-2301, 1988). MALDI ha sido aplicado al análisis del ADN en diferentes formas, desde el análisis de productos de PCR, a enfoques que utilizan la terminación específica de alelo, o reacciones de extensión de cebador de nucleótidos únicos, la secuenciación y la hibridación (patentes US nº 5.885.775, WO 96/29431, US nº 5.691.141, WO 97/37041, WO 94/16101, WO 96/27681, GB nº 2.339.279).

Tal como se ha indicado anteriormente, las desventajas principales de la mayoría de estos enfoques son que se basan en gran medida en procedimientos astringentes de purificación previos al análisis de MALDI que no permiten una fácil automatización y constituyen una parte importante de los costes. Frecuentemente se utiliza la purificación en columna giratoria y/o la tecnología de perlas magnéticas y la purificación en fase.

En el futuro se dispondrá de la secuencia completa del genoma y en la actualidad se están estableciendo mapas de los SNP, por lo que resultará deseable llevar a cabo la determinación de SNP en múltiples regiones del genoma de un individuo con el fin de determinar, por ejemplo, su susceptibilidad a una enfermedad basada en múltiples genes. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar un método que permita la generación de una representación del ADN genómico y el análisis de los SNP que podrían encontrarse presentes en estas regiones, determinando dichos SNP, por ejemplo, mediante análisis informático de las regiones que se generen, y no determinando el SNP de interés antes de generar las regiones que contienen dichos polimorfismos, tal como proponen los métodos actuales.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método universal y genético para resolver dicho problema. Un objetivo de la presente invención consiste asimismo en proporcionar un procedimiento para el análisis de SNP que resulte sencillo, económico, altamente multiplexable, fácilmente automatizable y que permita un alto rendimiento.

El procedimiento según la invención utiliza el potencial de una preparación altamente paralela de productos específicos de alelo, su acondicionamiento de manera que no requieran purificación y el potencial de los espectrómetros de masas para distinguir simultáneamente un gran número de productos en un espectro y de registrar un único espectro en unos cuantos segundos, alcanzando simultáneamente una relación de señal a ruido apropiada.

Resulta realmente difícil ajustar la sensibilidad (relación de señal a radio) y la complejidad (multiplexado) de los procedimientos de genotipado.

La invención proporciona un método para el genotipado que comprende...

1. Método para el genotipado de polimorfismos de un nucleótido único (SNP) mediante espectrometría de masas, que comprende las etapas siguientes: