CARBOXIPEPTIDASA B RECOMBINANTE Y SU PURIFICACION.

Un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B,

que comprende los pasos de

(a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en una procarboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal con una cola de histidinas y un péptido señal, siendo el péptido señal la secuencia N-terminal de la pre-proteína, e insertándose opcionalmente entre la cola de histidinas y el péptido señal o entre la cola de histidinas y la carboxipeptidasa B de rata una secuencia espaciadora;

(b) transformar un organismo microbiano huésped con el vector;

(c) cultivar el organismo microbiano huésped en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, expresando el organismo microbiano huésped la pre-proteína y secretándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina al medio de cultivo;

(d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada al medio de cultivo del paso (c) en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unir la cola de histidinas, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, inmovilizándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina;

(e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, escindiéndose así proteolíticamente la porción pro-carboxipeptidasa B y liberándose la proteína con actividad carboxipeptidasa B a la fase líquida, mientras la porción propéptido con colas de histidina está inmovilizada;

(f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que está inmovilizada la porción propéptido con colas de histidina; y

(g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f)

Carboxipeptidasa B recombinante y su purificación.

La presente invención pertenece al campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención pertenece a la producción y posterior procesamiento de un precursor enzimáticamente inactivo de una proteína con actividad carboxipeptidasa B. Un aspecto de la invención pertenece a la activación y purificación concomitante de la proteína con actividad carboxipeptidasa B.

Las carboxipeptidasas son enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos C-terminal. La familia de la carboxipeptidasa incluye metalo-, serina, y cisteína carboxipeptidasas. De acuerdo con su especificidad de sustrato, estas enzimas se denominan carboxipeptidasa A (escindiendo residuos alifáticos) o carboxipeptidasa B (escindiendo residuos amino básicos). La carboxipeptidasa B (EC 3.4.17.2) es una enzima que cataliza la hidrólisis de los aminoácidos básicos, Lisina, Arginina, y Ornitina a partir de la posición C-terminal en los polipéptidos:

Peptidil-L-Lisina(aminoácido -L-básico) + H₂O rightarrow Péptido + L-Lisina(aminoácido -L-básico)

El precursor de la carboxipeptidasa B es un zimógeno o proenzima en el páncreas de la mayoría de vertebrados (revisado por Folk J. Carboxypeptidase B, en: The Enzymes 3, P. Boyer, Academic Press, NY, 57, 1971). La carboxipeptidasa B puede funcionar en la posterior degradación de productos provenientes de la digestión con tripsina, para los que son muy específicos, como la carboxipeptidasa A es específica para los productos de quimiotripsina. La carboxipeptidasa B también posee una actividad esterasa que está relacionada con el contenido metálico de la enzima (Folk, J., y Gladner, J.: Biochim Biophys Acta (1961) 48, 139-47; Zisapel, N. y Sokolovsky, M, Eur J Biochem (1975) 54, 541-7).

Un "zimógeno" o una "proenzima" es el precursor inactivo de una enzima. En otras palabras, un zimógeno o una proenzima es el precursor inactivo de una proteína con actividad enzimática como una proteína con actividad carboxipeptidasa B. Muchas proteínas con actividad enzimática se sintetizan como dichos precursores inactivos y se activan posteriormente mediante escisión de uno a varios enlaces péptidos específicos. La activación de enzimas y otras proteínas mediante proteólisis especifica ocurre frecuentemente en los sistemas biológicos. Por ejemplo: (a) La proteína fibrosa de colágeno que está presente en la piel y huesos deriva del procolágeno que es un precursor soluble, (b) Algunas proteínas de hormonas se sintetizan como precursores inactivos. Por ejemplo, la insulina deriva de la proinsulina mediante eliminación proteolítica de un péptido. (c) Las enzimas digestiva que hidrolizan proteínas se sintetizan y secretan como zimógenos en el estómago y el páncreas. La carboxipeptidasa B pertenece a este grupo, (d) La coagulación de la sangre está mediada mediante una cascada de activaciones proteolíticas que aseguran una respuesta rápida y amplificada al trauma.

In vivo el zimógeno de la carboxipeptidasa B, es decir, la "pro-carboxipeptidasa B", se traduce en las células pancreáticas como una pre-proteína denominada "pre-pro-carboxipeptidasa B".

La pre-pro-carboxipeptidasa B comprende en su N-terminal un péptido señal. La secuencia de aminoácidos de la pre-pro-carboxipeptidasa B describe el producto traduccional primario. El péptido señal dirige al polipéptido de la pre-pro-carboxipeptidasa B hacia la ruta de secreción de la célula pancreática. Durante el proceso de secreción el péptido líder se escinde proteolíticamente, convirtiendo así la pre-pro-carboxipeptidasa B en la pro-carboxipeptidasa B.

La pro-carboxipeptidasa B está desprovista de actividad enzimática. La activación in vivo normalmente tiene lugar en el intestino delgado. La tripsina rompe la pro-carboxipeptidasa B, generando así un propéptido enzimáticamente inactivo y la enzima carboxipeptidasa B proteolíticamente activa.

Como ejemplo para la pre-pro-carboxipeptidasa, el Id. de Sec. Nº: 1 describe la secuencia de aminoácidos de la pre-pro-carboxipeptidasa B de rata como se publicó en Clauser E. et al., J. Biol. Chem. 1988, Vol. 263, 17837-45. De acuerdo con esto, los primeros 13 aminoácidos del polipéptido de la pre-pro-carboxipeptidasa B representan el péptido señal y los siguientes 95 aminoácidos constituyen el propéptido. El producto de activación, es decir, la enzima carboxipeptidasa B de rata activa contiene 307 aminoácidos con un peso molecular calculado de 35.228 Da.

Al utilizar tripsina, la pro-carboxipeptidasa B puede también activarse in vitro para formar la carboxipeptidasa B. La conformación del propéptido y la porción de enzima han demostrado mediante métodos analíticos como las electroforesis en gel de SDS así como HPLC de fase reversa de Ventura et al. J. Biol. Chem. (1999) 274(28), 19925-33.

Los experimentos de activación in vitro bajo varias condiciones han demostrado que mientras una enzima carboxipeptidasa B proteolíticamente activa se genera fácilmente, bajo condiciones no desnaturalizantes, el propéptido permanece unido de forma no covalente a un gran número de moléculas de carboxipeptidasa B. Esto se puede ver cuando las condiciones desnaturalizantes se aplican al complejo de propéptido y enzima. Así, los métodos de purificación no desnaturalizantes y en particular la cromatografía de intercambio de aniones no proporcionan ni de cerca medios suficientes para separar el propéptido unido de forma no co-valente de la enzima carboxipeptidasa B.

Debido a su gran especificidad para los aminoácidos básicos en C-terminal, se ha encontrado un amplio uso para la carboxipeptidasa B, por ejemplo en el análisis de final de grupo para la determinación de secuencias. No obstante, es de mayor importancia económica la aplicación industrial que implica el procesamiento proteolítico. En particular, la carboxipeptidasa B se utiliza en los procesos de producción que conducen a la insulina para su uso médico y que involucran la escisión proteolítica de la pro-insulina.

Respecto a la insulina como producto medico, surge un problema concreto a favor del propéptido de la carboxipeptidasa B que no está covalentemente unido a la enzima carboxipeptidasa B. En dichos procesos de producción de insulina, tras la escisión proteolítica de la pro-insulina, el fragmento de insulina se purifica bajo condiciones desnaturalizantes. Como consecuencia, es posible que el propéptido de la carboxipeptidasa B se copurifique con la insulina. En tal caso, la separación del propéptido de la carboxipeptidasa B de la molécula de insulina puede ser un proceso laborioso que al mismo tiempo disminuya probablemente la proporción final de insulina purificada.

La carboxipeptidasa B purificada disponible comercialmente a partir de páncreas porcino puede que no esté totalmente libre de otras actividades proteolíticas. Además, como es el caso para la mayoría de productos derivados de animales, la carboxipeptidasa B porcina puede contener agentes infecciosos como virus, priones, u otros componentes biológicamente activos con potencial deletéreo para la salud humana. Por lo tanto, es deseable obtener carboxipeptidasa B a partir de una fuente alternativa. Además, es deseable que la carboxipeptidasa B de la fuente alternativa esté sustancialmente libre de propéptido.

Se conoce en la materia que la carboxipeptidasa B puede producirse de forma recombinante en organismos huésped transformados (por ejemplo Ventura et al. J. Biol. Chem. (1999) 274(28), 19925-33) y purificarla a partir de ellos.

WO 01/51624 describe la expresión recombinante de pro-carboxipeptidasa B porcina en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Tras la activación del zimógeno a través de la escisión tríptica, un primer paso de purificación incluye la cromatografía hidrofóbica. Tras la adición del inhibidor de la tripsina de semilla de soja, la enzima activada se purifica posteriormente utilizando cromatografía con Q-sepharose. El método de purificación de WO 01/51624 involucra pasos múltiples y existe una pérdida concomitante de producto de carboxipeptidasa B. Además, existe la necesidad de separar el inhibidor de la tripsina de semilla de soja así como el propéptido de la carboxipeptidasa B del producto.

DE 19 915 938 describe la expresión recombinante de una pro-carboxipeptidasa B humana con colas de histidina en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. El producto se purifica utilizando cromatografía de afinidad y mediante...

1. Un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B, que comprende los pasos de

(a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en una procarboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal con una cola de histidinas y un péptido señal, siendo el péptido señal la secuencia N-terminal de la pre-proteína, e insertándose opcionalmente entre la cola de histidinas y el péptido señal o entre la cola de histidinas y la carboxipeptidasa B de rata una secuencia espaciadora;

(b) transformar un organismo microbiano huésped con el vector;

(c) cultivar el organismo microbiano huésped en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, expresando el organismo microbiano huésped la pre-proteína y secretándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina al medio de cultivo;

(d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada al medio de cultivo del paso (c) en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unir la cola de histidinas, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, inmovilizándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina;

(e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, escindiéndose así proteolíticamente la porción pro-carboxipeptidasa B y liberándose la proteína con actividad carboxipeptidasa B a la fase líquida, mientras la porción propéptido con colas de histidina está inmovilizada;

(f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que está inmovilizada la porción propéptido con colas de histidina; y

(g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que la cepa microbiana huésped es una cepa de levadura metilotrófica.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza por que la secuencia de aminoácidos de la pro-carboxipeptidasa B de rata es la secuencia de aminoácidos desde la posición 14 a la posición 415 del Id. de Sec. Nº: 3.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza por que el péptido señal contiene una secuencia señal de escisión de una peptidasa que está localizada adyacente a la cola de histidinas o adyacente a la secuencia espaciadora.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por que la secuencia de aminoácidos de la pre-proteína expresada es la secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. Nº: 4.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza por que la secuencia de nucleótidos que codifica la pro-carboxipeptidasa B de rata es la secuencia de nucleótidos desde la posición 286 a la posición 1.497 del Id. de Sec. Nº: 3.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza por que la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína es la secuencia de nucleótidos del Id. de Sec. Nº: 3.