Xilanasas modificadas que exhiben expresión mejorada.

Una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que comprende,

una secuencia que introduce un sitio de Nglucosilación consensus eucariótico funcional que consiste de la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Ihr (N-X5 S/T) que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, el sitio de N-glucosilación producido por la sustitución de un aminoácido (X) en una asparagina (N) en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 34 (X34N), posición 131 (X131N), posición 180 (X180N), posición 182 (X182N), y una combinación de las mismas, la posición determinada de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada, cuando se expresa en una cepa anfitriona Trichoderma, exhibe un aumento en la eficiencia de la expresión de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de la xilanasa de la Familia 11 fúngica correspondiente de la cual se deriva la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada.

Xilanasas Modificadas que Exhiben Expresión Mejorada La presente invención se relaciona con xilanasas con expresión mejorada, más particularmente con la expresión mejorada y la secreción de xilanasas de un anfitrión.

Antecedentes de la invención

Las xilanasas, producidas por muchas especies de hongos filamentosos y bacterias, son un grupo de enzimas con amplia utilidad comercial. Una aplicación principal de las xilanasas es para bioblanquear la pulpa en la producción de papel. Adicionalmente, se han utilizado xilanasas como agentes clarificantes en jugos y vinos, como agentes enzimáticos en el lavado o dispositivos y semiconductores y también se pueden utilizar para mejorar la digestibilidad de alimento para cerdos y aves.

La mayor parte de la xilanasa explotada para aplicaciones industriales son miembros de la Familia 11, que muestran diversidad en sus propósitos bioquímicos y biofísicos. Por ejemplo, se han aislado xilanasas termoestables de las bacterias (US 6, 667, 170) , hongos (US 6, 635, 464) , u otros termófilos extremos (Lüthi et al. 1990; Winterhalter et al. 1995; Simpson et al. 1991) . Alternativamente se ha optimizado el desempeño de la xilanasa para diversas aplicaciones industriales por medio de la ingeniería de la proteína (por ejemplo U.S. 5, 759, 840; U.S. 5, 866, 408; U.S. 5, 405, 769; y Turumen et al., 2001) .

La implementación exitosa de las enzimas de xilanasa en las aplicaciones industriales requiere producción económica a partir de un microbio anfitrión, que secreta la xilanasa en el caldo de cultivo durante fermentación por inmersión. Esto es particularmente necesario para la producción a gran escala de las xilanasas desde termófilos o termófilos extremos que son difíciles de cultivar o que no secretan niveles de proteína suficientemente altos. Típicamente, el microbio anfitrión para la producción de enzimas industriales es un hongo filamentoso tal como Trichoderma, Aspergillus o Fusarium, un actinomicete tal como Streptomyces o una especie de bacteria Bacilhus. Esto significa que los genes que codifican una xilanasa objetivo, si se aíslan de un organismo diferente o de la proteína, la construcción por ingeniería del gen xilanasa del organismo anfitrión, se puede clonar en la producción del anfitrión en tal forma que el gen se liga operablemente a las secuencias de ADN que facilitará su expresión y secreción del anfitrión.

La expresión y secreción de las proteínas exógenas mediante modificación genética de las cepas industriales de T. reesei ha permanecido como un reto significativo durante muchos años (Conesa et al., 2001) . La expresión de las proteínas heterólogas en T. reesei provoca una respuesta de Proteína No plegada (UPR; Saloheimo et al., 1999) , que resulta de una acumulación de los polipéptidos nacientes no plegados o plegados en forma incorrecta en el lumen del retículo endoplásmico (ER) . Debido a la información limitada actualmente disponible sobre los mecanismos que regulan el plegamiento y la secreción de las xilanasas de la Familia 11 de T. reesei, se han implementado diversas estrategias para facilitar la expresión de alto nivel de las xilanasas exógenas relacionadas en la cepas anfitrionas T. reesei. Estas incluye el uso de promotores altamente inducibles, tales como aquellas de los genes celulasa T. reesei, y reemplazo de los genes de celulosa naturales con construcciones de expresión de xilamasa que contienen promotores altamente inducibles.

La expresión de las xilanasas bacterianas de T. reesei puede requerir la fusión de la xilanasa a un portador de polipéptido T. reesei con una estructura de dominio intacto, tal como el núcleo catalítico o los dominios de unión de las proteínas mannanasa I T. reesei o CBH II (Paloheimo, et al., 2003) . Esta estrategia, sola o en combinación con la eliminación de uno o más genes de celulasa de la cepa anfitriona T. reesei, se describe en la US 6, 635, 464 y US 6, 667, 170 para dirigir la expresión de las xilanasas de la Familia 11 termófila de expresión de fuentes bacterianas (A. flexuosa) y fúngicas (C. thermophilus) . Aunque el polipéptido portador aumenta ciertamente la producción y la secreción de las xilanasas heterólogas descritas en la US 6, 635, 464 y US 6, 667, 170 de las cepas anfitrionas T. reesei, no siempre es deseable tener un polipéptido portador unido a la enzima de xilanasa para aplicaciones industriales. En estos casos, el polipéptido portador necesitaría ser retirado mediante proteólisis posterior al periodo de la proteína de fusión en el caldo de cultivo y antes de su uso en la aplicación. Sin embargo la proteólisis agrega tiempo y costes para la producción general de la xilanasa objetivo debido a los costes y tiempo de incubación requeridos para la etapa de proteólisis en sí misma así como también como la pérdida de rendimiento potencial de la xilanasa objetivo durante la remoción proteolítica del polipéptido portador.

Esta estrategia para utilizar una fusión de una proteína objetivo a una proteína portadora natural a la célula anfitriona que también se ha empleado exitosamente para aumentar la producción y la secreción de quimosina de mamífero de Aspergillus (Van den Brink et al., WO 02/36752 y WO 03/106484) . La WO 03/106484 describe mejoras adicionales en la producción y la secreción de las proteínas de fusión de glucoamilasa-quimosina de Aspergillus mediante la introducción de un motivo de N-glucosilación dentro del polipéptido ligador artificial entre los patrones de fusión de quimosina y glucoamilasa o dentro de la secuencia de péptido quimosina. Sin embargo, no existedemostración de los beneficios de la producción de quimosina de Aspergillus por medio de la introducción de un motivo de glucosilación en una construcción que no contiene un socio de fusión.

Sagt et al. (2000) reporta mejoras en la secreción de una proteína objetivo de un anfitrión eucariótico heterológo por medio de la introducción de un motivo de N-glucosilación dentro de la proteína objetivo. En este informe, la introducción de un sitio de N-glucosilación dentro de la secuencia de un mutante hidrófobo de una cutinasa fúngica o de los fragmentos de anticuerpo naturales que resulta en la secreción aumentada de la proteína objetivo de un anfitrión de levadura Saccharomyces o Pichia. Sin embargo, la introducción del sitio de glucosilación en la cutinasa fúngica natural no resulta en ningún aumento en la expresión de los anfitriones de levadura heterólogos.

La WO 02/02597 reporta la producción de la subunidad FSH-alfa y los polipéptidos glucocerebrosidasa que contienen un sitio de glucosilación. La meta de estos estudios es mejorar la estabilidad y la expresión de estos polipéptidos. Sin embargo, la aplicabilidad del método solo se demuestra utilizando la adición de las secuencias de nucleótido cortas que codifican el motivo de N'-glucosilación por medio de la modificación directa de la secuencia de péptido principal.

Es un objeto de la presente invención proporcionar xilanasas modificadas que exhiben expresión mejorada.

Resumen de la invención La presente invención se relaciona con xilanasas con expresión mejorada, más particularmente con la expresión mejorada y la secreción de xilanasas de un anfitrión.

La presente descripción proporciona una xilanasa de la Familia 11 modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de N-glucosilación consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada. La xilanasa de la Familia 11 modificada puede comprender una sustitución de un aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 34 (X34N) , posición 131 (X131N) , posición 180 (X180N) , posición 182 (X182N) , y una combinación de las mismas, en una asparagina, la posición se determina de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1. La presente invención también pertenece a una xilanasa de la Familia 11 modificada como se describió anteriormente, y que comprende adicionalmente, una sustitución de un aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 36 (X34N-S36T) , posición 182 (X180NS182T) , posición 184 (X182N-S184T) , y una combinación de las mismas, con una treonina, Preferiblemente, la xilanasa de la Familia 11 modificada comprende una mutación X131N. También se proporciona una xilanasa de la Familia 11 modificada seleccionada del grupo que consiste de: ITX1, ITX2,... [Seguir leyendo]

1. Una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que comprende, una secuencia que introduce un sitio de Nglucosilación consensus eucariótico funcional que consiste de la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Ihr (N-X5 S/T) que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, el sitio de N-glucosilación producido por la sustitución de un aminoácido (X) en una asparagina (N) en una posición seleccionada del grupo que consiste de la posición 34 (X34N) , posición 131 (X131N) , posición 180 (X180N) , posición 182 (X182N) , y una combinación de las mismas, la posición determinada de la alineación de secuencia de la xilanasa de la Familia 11 con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa II Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada, cuando se expresa en una cepa anfitriona Trichoderma, exhibe un aumento en la eficiencia de la expresión de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de la xilanasa de la Familia 11 fúngica correspondiente de la cual se deriva la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada.

2. La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1 que comprende, X131N.

3. La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1, en donde la sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste de: sustitución en la posición 34 (X34N) y adicionalmente comprende una sustitución para una treonina en la posición 36 (S36T) , sustitución en la posición 180 (X180N) y que comprende adicionalmente una sustitución para una treonina en la posición 182 (S182T) ; sustitución en la posición 182 (X182N) y que comprende adicionalmente una sustitución para una treonina en la posición 184 (S184T) ; y una combinación de las mismas.

4. La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica es xilanasa 1 o xilanasa 2 de Trichoderma reesei.

5. La xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de la Reivindicación 1, en donde la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada es Trichoderma reesei xilanasa I como se define en la SEQ ID:2 que comprende una sustitución

de aminoácido de T131N, la posición se determina de la alineación de secuencia de la Xilanasa 1 de Trichodenna reesei con la secuencia de aminoácidos de la xilanasa 11 de Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO:1.

6. Una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que comprende una secuencia que introduce un sitio de glucosilación N consensus funcional que no se encuentra de otra forma en la xilanasa de la Familia 11 fúngica de la que se deriva la xilanasa de la Familia 11 modificada, en donde la xilanasa de la Familia 11 modificada se selecciona del grupo que consiste de:

Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, T13N, H144R, N157D, Q161R, Q162H, y T165H,

Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, T131N, Y135R, H144R, N157D, Q161R, Q162H, y T165H;

Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, H144R, N157D, Q161R, Q161H, T165H y F180N;

Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, 1129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H, T165H, F180N y S182T;

Xilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, 40 Q162H, T165H y S182N; X

ilasa II de Trichoderma reesei con N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H, T165H, S182N y S184T;

Xilasa II de Trichoderma reesei con, N10H, Y27M, N29L, Q34N, S75A, L105H, Q123A, I129E, H144R, N157D, Q16R, Q162H y T165H; y 45 Trichoderma raesei xilanasa II con N10H, Y27M, N29L, Q34N, S36T, S75A, L10SH, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H y T165H.

7. Una construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada que comprende un promotor ligado operativamente a una señal de secreción que se liga operativamente a una región codificante que codifica una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada como se define en la reivindicación 1, la construcción génica de xilanasa modificada resulta en un aumento en la expresión, eficiencia de la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de por lo menos 40% cuando se compara con la eficiencia de la expresión de una xilanasa de la Familia 11 fúngica correspondiente de la cual se deriva la xilanasa modificada, dicha xilanasa de la Familia 11 fúngica codificada correspondiente de la que se deriva la xilanasa modificada codificada se expresa de una construcción génica que comprende el mismo promotor ligado operativamente y la señal de secreción como dicha construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada.

8. La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 7, en donde la señal de secreción es una señal de secreción Trichoderma.

9. La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 8, en donde la señal de secreción Trichoderma es una la señal de secreción xilanasa.

10. La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 9, en donde la señal de secreción xilanasa es una señal de secreción de xilanasa Trichoderma o una Señal de secreción II de xilanasa II Trichoderma.

11. La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 7, en donde la región codificante codifica una xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada que se deriva de Xilasa II de Trichoderma reesei como se define en la SEQ ID NO: 1, cuya xilanasa comprende adicionalmente las sustituciones de aminoácido N10H, Y27M, N291, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R, N157D, Q161R, Q162H, y T165R.

12. La construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de la Reivindicación 7, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste de un promotor de Trichoderma cbh1, un promotor cbh2, un promotor eg1, un promotor eg2, un promotor eg3, un promotor eg5, un promotor xln1, un promotor xln2, y una combinación de dos o más de dos de estos promotores.

13. Un microbio genéticamente modificado que comprende la construcción génica de xilanasa de la Familia 11 modificada de una cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 12.

14. El microbio genéticamente modificado de la Reivindicación 13, en donde el microbio comprende un miembro del género de Trichoderma o Hypocrea.

15. Un método para procesar alimentos que comprende, tratar el alimento con la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6.

16. El método como se define en la Reivindicación 15, en donde el alimento se selecciona del grupo que consiste de un alimento para aves, un alimento para cerdos, un alimento utilizado en panadería, o un alimento utilizado en bebidas.

17. Un método para fabricación de pulpa que comprende tratar la pulpa con la xilanasa de la Familia 11 modificada de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6.

18. El uso de la xilanasa de la Familia 11 fúngica modificada en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6 en un proceso alimenticio o industrial.

19. El uso como se define en la Reivindicación 18, en donde el proceso industrial es fabricación de pulpa.

FIGURA 1 FIGURA 1 CONT. FIGURA 1 CONT. Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5A Figura 5B Figura 6 Figura 7