Una vacuna frente al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de Tipo 1 norteamericano(US1PRRSV),

que comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante de SEC ID NO: 43.

Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de tipo 1 norteamericano recombinante y métodos de uso

Campo técnico

Esta solicitud se refiere al campo de la virología molecular, y más particularmente a la construcción de ácidos nucleicos recombinantes que codifican el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) .

Antecedentes

El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) es la enfermedad económicamente más importante de los cerdos a nivel mundial. Se caracteriza por insuficiencia reproductiva a largo plazo en cerdas, y neumonía grave en cerdos neonatales. El virus del PRRS (PRRSV) consiste en dos genotipos principales, el genotipo europeo (Tipo 1) y el genotipo norteamericano (Tipo 2) , cada uno localizado en otro tiempo en continentes diferentes. Más recientemente, se han identificado aislados del PRRSV del Tipo 1 (Tipo 1 norteamericano) en porquerizos de los Estados Unidos de América. Este grupo de virus posee características antigénicas y genéticas únicas que son distintas del PRRSV de tipo norteamericano y europeo típico. Se ha identificado una supresión única de 51 pb en la región inmunodominante del Nsp2. El agente etiológico de PRRS es un virus pequeño con cubierta, que contiene un genoma de ARN monocatenario positivo. PRRSV pertenece a la familia Arteriviridae, que incluye el virus de la artritis equina (EAV) , el virus que aumenta la lactato deshidrogenasa (LDV) , y el virus de la fiebre hemorrágica de los simios (SHFV) (Snijder y Meulenberg, 1998) . Las comparaciones de las secuencias nucleotídicas mostraron que PRRSV se puede dividir en genotipos europeo (Tipo 1) y norteamericano (Tipo 2) distintos (Allende et al., 1999; Nelson et al., 1999) .

El genoma del PRRSV tiene una longitud de alrededor de 15 kb, y contiene nueve marcos de lectura abiertos. El extremo 3’ del genoma codifica cuatro glucoproteínas asociadas a la membrana (GP2a, GP3, GP4 y GP5; codificadas por ARNm subgenómicos 2-5) , dos proteínas de membrana no glucosiladas (E y M; codificadas por ARNm subgenómicos 2 y 6) y una proteína de la nucleocápside (N; codificada por ARNm subgenómico 7) (Bautista et al., 1996; Mardassi et al., 1996; Mcng et al., 1996; Meulenberg &dcn Besten, 1996; Meulenberg et al., 1995; Mounir et al., 1995; Wu et al., 2001, 2005) . Los genes asociados a replicasas, ORF1a y ORF1b, situados en el extremo 5’ del genoma, representan casi el 75% del genoma vírico. Se predice que la proteína pplab codificada por ORF1ab es escindida en 12 sitios para formar 13 productos: nsp1α, nsp1β, y nsp2 a nsp12 (Allende et al., 1999; den Boon et al., 1995; Nelson et al., 1999; Snijder y Meulenberg, 1998) .

Actualmente existen vacunas atenuadas vivas modificadas frente a PRRSV para la reducción de la enfermedad clínica asociada con PRRSV (Boehringer-Ingelheim Animal Health, Inc.) . Sin embargo, no se pueden distinguir serológicamente entre cerdos que se han recuperado de una infección natural y aquellos que se han vacunado. Una vacuna genéticamente marcada permitiría la diferenciación entre cerdos vacunados e infectados naturalmente, lo que se necesita para programas de control y erradicación de PRRSV.

Sumario

A título de descripción general, se describe un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino recombinante (PRRSV) que incluye una o más mutaciones en el marco de lectura abierto (ORF) Ia, siendo las mutaciones tales que el PRRSV recombinante no produce al menos un polipéptido funcional que corresponde a ORFIa. La mutación puede ser una supresión. Una supresión puede estar en la región nsp2, y puede incluir el epítopo ES4. En una realización, la supresión incluye los aminoácidos 736-790 de ORFIa. La mutación puede incluir una inserción de una secuencia de ADN heteróloga. Una inserción puede estar entre los aminoácidos 733 y 734 de ORFIa. La inserción puede incluir la proteína fluorescente verde (GFP) .

Se describe una vacuna que incluye un mutante de PRRSV que tiene una mutación en ORFIa, siendo la mutación tal que dicho mutante de PRRSV no produce un polipéptido de ORFIa funcional, y la vacuna incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. La mutación puede incluir una supresión en la región nsp2, tal como una supresión de aminoácidos 736-790 en la región nsp2. La mutación puede incluir una inserción de una secuencia de ADN heteróloga. La inserción puede estar entre los aminoácidos 733 y 734 en la región nsp2.

Se describe un kit que incluye una vacuna que incluye un mutante de PRRSV que tiene una mutación en ORFIa, siendo la mutación tal que dicho mutante de PRRSV no produce un polipéptido de ORFIa funcional, incluyendo la mutación una inserción de una secuencia de ADN heteróloga, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El kit incluye además uno o más primeros polipéptidos codificados por la secuencia de ADN heteróloga, y uno o más segundos polipéptidos codificados por ORFIa funcional. La mutación en la vacuna de PRRSV puede ser una supresión en la región nsp2, tal como en un epítopo ES4, y el uno o más primeros polipéptidos incluyen GFP y el uno o más segundos polipéptidos incluyen el epítopo ES4.

Se proporciona un método para diferenciar un animal vacunado con una vacuna marcadora de PRRSV de un animal infectado naturalmente con PRRSV, en el que la vacuna marcadora de PRRSV comprende un PRRSV recombinante que incluye una mutación de inserción y una mutación de supresión. El método incluye las etapas de proporcionar una primera proteína de PRRSV recombinante que incluye la mutación de inserción, proporcionar una segunda proteína de PRRSV recombinante que incluye la mutación de supresión, incubar una muestra sérica procedente del animal con las proteínas de PRRSV recombinantes primera y segunda, y detectar la unión de anticuerpos en la muestra con las proteínas de PRRSV recombinantes primera y segunda. La unión de anticuerpos en la muestra con la primera proteína de PRRSV recombinante es indicativa de un animal vacunado, y la unión de anticuerpos en la muestra con la segunda proteína de PRRSV recombinante es indicativa de un animal infectado naturalmente. La primera proteína de PRRSV recombinante puede incluir una inserción de GFP, y la segunda proteína de PRRSV recombinante puede incluir una supresión de ES4.

Frente a este antecedente, la invención se refiere a los siguientes aspectos:

1. Una vacuna frente al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de Tipo 1 norteamericano (USIPRRSV) , que comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante de SEC ID NO: 43.

2. Un método para diferenciar un animal infectado naturalmente con un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de Tipo 1 norteamericano (US1 PRRSV) de un animal vacunado con una vacuna marcadora de US1 PRRSV, en el que dicha vacuna marcadora comprende un US1 PRRSV recombinante en el que se ha insertado un antígeno extraño (marcador positivo) y en el que se ha suprimido un epítopo inmunógeno (marcador negativo) , comprendiendo el método de diferenciación:

incubar una muestra sérica procedente del animal con una primera proteína de PRRSV recombinante que contiene el marcador positivo, y con una segunda proteína de PRRSV recombinante que carece del epítopo inmunógeno (marcador negativo) , y

detectar la unión de anticuerpos en la muestra con las proteínas de PRRSV primera y segunda, en el que la unión de anticuerpos a la proteína que contiene el marcador positivo es indicativa de un animal vacunado, mientras que la unión de anticuerpos a la proteína que contiene el marcador negativo es indicativa de un animal infectado naturalmente.

En una realización preferida, la vacuna marcadora es la vacuna de (1) . Breve descripción de los dibujos La FIG. 1 es una representación esquemática del genoma de PRRSV y la estrategia de clonación. Las FIGS. 2A-2F representan el resultado de ensayos de inmunofluorescencia llevados a cabo para investigar la

infecciosidad del clon infeccioso pSD01-08.

La FIG. 3 es una gráfica que muestra la cinética de crecimiento de virus clonado, virus progenitor, y virus que expresa GFP. La FIG. 4 representa patrones de fragmentos de endonucleasas de restricción de los productos de RT-PCR del virus

clonado y progenitor SD01-08. Las FIGS. 5A y 5B son gráficas que muestran la caracterización in vivo de virus clonados. Las FIGS. 6A-6C representan... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna frente al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de Tipo 1 norteamericano (US1PRRSV) , que comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante de SEC ID NO: 43.

2. Un método para diferenciar un animal infectado de forma natural con un virus del síndrome reproductivo y

respiratorio porcino de Tipo 1 norteamericano (US1 PRRSV) de un animal vacunado con una vacuna marcadora de US 1 PRRSV, en el que dicha vacuna marcadora comprende un US1 PRRSV recombinante en el que se ha insertado un antígeno extraño (marcador positivo) y en el que se ha suprimido un epítopo inmunógeno (marcador negativo) , comprendiendo el método de diferenciación:

incubar una muestra de suero procedente de un animal con una primera proteína de PRRSV recombinante

que contiene el marcador positivo, y con una segunda proteína de PRRSV recombinante que carece del epítopo inmunógeno (marcador negativo) , y

detectar la unión de anticuerpos en la muestra con las proteínas de PRRSV primera y segunda, en el que la unión de anticuerpos a la proteína marcadora positiva es indicativa de un animal vacunado, mientras que la unión de anticuerpos a la proteína marcadora negativa es indicativa de un animal infectado de forma natural.

3. Un método de la reivindicación 2, en el que la vacuna marcadora es la vacuna de la reivindicación 1.