Vesículas de membranas externas bacterianas mejoradas.

Un procedimiento para la elaboración de una preparación de vesículas de membranas externas a partir de una bacteria Gram-negativa recombinante que sobre-expresa el inmunógeno 741

, en el que la membrana bacteriana es sustancialmente rota en ausencia de detergente de desoxicolato.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07012893.

Solicitante: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS S.R.L..

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA FIORENTINA 1 53100 SIENA (SI) ITALIA.

Inventor/es: PIZZA, MARIAGRAZIA, RAPPUOLI, RINO, SERRUTO,DAVIDE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/112 (Salmonella; Shigella)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K9/00 (Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto particular)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/095 (Neisseria)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/104 (Pseudomonas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/06 (Lisis de microorganismos)

PDF original: ES-2483592_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Vesículas de membranas externas bacterianas mejoradas CAMPO TÉCNICO

Esta invención pertenece al campo de la preparación de vesículas para fines de inmunización. ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Una de las diversas aproximaciones a la inmunización frente a una infección de N. meningitidis es usar vesículas de membranas externas (OMVs). Una vacuna de OMV eficaz frente al serogrupo B ha sido producida por el instituto Nacional Noruego de la Sanidad Pública [por ejemplo, referencia 1] pero, aunque está vacuna es segura y previene la enfermedad MenB, su eficacia está limitada a la cepa usada para preparar la vacuna.

La vacuna "RIVM" está basada en vesículas que contienen seis subtipos diferentes de PorA y se ha mostrado que es inmunógena en niños en ensayos clínicos de fase II. [2].

La referencia 3 describe una vacuna contra diferentes serotipos patógenos de meningococo del serogrupo B basada en OMV que retiene un complejo de proteínas de 65 kDa. La referencia 4 describe una vacuna que comprende OMV de cepas meningocócicas tratadas por ingeniería genética, en las que las OMVs comprenden: al menos una proteína de membrana externa (OMP) de clase 1 pero que no comprende OMP de clase 2/3. La referencia 5 describe OMVs que comprenden OMPs que tienen mutaciones en sus bucles superficiales y OMVs que comprenden derivados de lipopolisacárido meningocócico (LPS).

La referencia 6 describe composiciones que comprenden OMVs complementadas con proteínas de unión de transferrina (por ejemplo, TbpA y TbpB) y/o superóxido-dismutasa Cu, Zn. La referencia 7 describe composiciones que comprenden OMVs complementadas con diversas proteínas. La referencia 8 describe preparaciones de vesículas de membranas obtenidas a partir de N. meningitidis con un gen furK modificado.

Además de N. meningitidis del serogrupo B, han sido preparadas vesículas a partir de otras bacterias. La referencia 9 describe un procedimiento para preparar vacunas basadas en OMV para meningococos del serogrupo A. Las referencias 10 y 11 describen vesículas a partir de N. gonorrhoeae. La Referencia 12 describe preparaciones de vesículas a partir de N. lactamica. Han sido preparadas también vesículas a partir de Moraxella catarrhalis [13,14], Shigella flexneri [15,16], Pseudomonas aeruginosa [15,16], Porphyromonas gingivalis [17], Treponema pallidum [18], Haemophilus influenzae [19 y 20] y Helicobacter pylorí [21].

Un inconveniente de las preparaciones de vesículas bacterianas es que no están presentes agentes protectores importantes. Para retener antígenos como nspA en preparaciones de OMV, la refe-rencia 20 expone que la expresión de NspA debe ser sobrerregulada con una desactivación concomitante de porA y cps. Es un objeto de la invención proporcionar preparaciones de vesículas adicionales y mejoradas, junto con procedimientos para su elaboración. En particular, es un objeto de la invención proporcionar vesículas que retengan componentes inmunógenos bacterianos importantes a partir de N. meningitidis.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los métodos de la técnica anterior para la preparación de OMV meningocócicos incluyen el uso de un detergente durante la rotura de la membrana bacteriana [por ejemplo, véase la referencia 22, en la que se usa un detergente de desoxicolato]. La invención está basada en el descubrimiento sorprendente de que la rotura de la membrana sustancialmente en ausencia de detergente da lugar a OMVs que retienen importantes componentes inmunógenos bacterianos, particularmente (i) la proteína de superficie de NspA protectora, (ii) la proteína "287" y (iii) la proteína "741".

Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento para la elaboración de una preparación de vesículas de membranas externas a partir de una bacteria, en la que la membrana de bacteria es rota sustancialmente en ausencia de detergente. Se proporcionan también preparaciones de OMVs que pueden ser obtenidas mediante procedimientos de la invención.

Para la obtención de vesículas de NspA+ve, el procedimiento de la invención es mucho más sencillo que realizar las múltiples manipulaciones genéticas descritas en la referencia 20.

El procedimiento de la invención incluirá normalmente las siguientes etapas básicas (a) tratar células bacterianas en ausencia sustancial de detergente; (b) centrifugar la composición de la etapa (a) para separar las vesículas de las membranas externas de las células tratadas y el debris celular y recoger la materia sobrenadante; (c) realizar una centrifugación a velocidad elevada de la materia sobrenadante de la etapa (b) y recoger las vesículas de membranas externas en un sedimento; (d) volver a dispersar el sedimento de la etapa (c) en un tampón; (e)

realizar una segunda centrifugación a velocidad elevada de acuerdo con la etapa (c) recogiendo las vesículas de membranas externas en un sedimento; (f) volver a dispersar el sedimento de la etapa (e) en un medio acuoso.

El procedimiento puede comprender también las siguientes etapas: (g) realizar una filtración en condiciones estériles a través de al menos dos filtros de tamaño de poros decreciente de la composición nuevamente dispersada de la etapa (f); y (h) opcionalmente, incluir la composición de la etapa (g) en un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una composición adyuvante.

La etapa (a) da lugar a vesículas de la membrana externa bacteriana, y las vesículas compren-den generalmente componentes de la membrana externa sustancialmente en su forma nativa. Ventajo-samente, son conservados los componentes de membranas de NspA "287" y "741".

La etapa (b) incluirá normalmente una centrifugación a aproximadamente 5.000-10.000 g durante hasta 1

hora.

Las etapas (c) y (e) incluirán normalmente una centrifugación a aproximadamente 35.000-100.000 g durante hasta 2 hora.

Las etapas de centrifugación son realizadas preferentemente entre 2°C y 8°C.

Puede ser usado cualquier tampón adecuado en la etapa (b) por ejemplo, tampón Tris, tampón de fosfato, tampón de histidina etc. La etapa (f) puede incluir también el uso de un tampón que puede ser el mismo tampón usado en la etapa (d) o puede Incluir sencillamente el uso de agua (por ejemplo, agua para inyección).

La etapa (g) finaliza preferentemente con un filtro con un tamaño de poros de aproximadamente 0,2 pm.

La invención proporciona también una composición de vesículas de N. meningitidis caracterizada porque las vesículas incluyen (i) proteína de NspA, (ii) proteína "287" y (iii) protelna "741".

La bacteria

La bacteria a partir de la cual son preparadas las OMVs puede ser gram-positiva, pero es preferentemente gram-negatlva. La bacteria puede ser del genero Moraxella, Shigella, Pseudomonas, Treponema, Porphyromonas o Helicobacter, (véase lo que antecede para las especies preferidas) pero es preferentemente del genero Neisseria. Las especies preferidas de Neisseria son N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Dentro de la N. meningitidis, puede ser usado cualquiera de los serogrupos A, C, W135 e Y, pero es preferido preparar vesículas a partir del serogrupo B. Las cepas preferidas dentro del serogrupo B son MC58, 2996, H4476 y 394/98.

Para reducir la actividad pirógena, es preferido que la bacteria tenga bajos niveles de endotoxinas (LPS). Son conocidas bacterias mutantes adecuadas, por ejemplo, Neisseria mutante [23] y Helicobacter mutante [24], Los procedimientos para preparar membranas externas agotadas en LPS a partir de bacterias gram-negativas se describen en la referencia 25.

La bacteria puede ser una bacteria de tipo salvaje o puede ser una bacteria recomblnante. Las bacterias recombinantes preferidas sobreexpresan (con relación a la correspondiente cepa de tipo salvaje) ¡nmunógenos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la elaboración de una preparación de vesículas de membranas externas a partir de una bacteria Gram-negatlva recombinante que sobre-expresa el inmunógeno 741, en el que la membrana bacteriana es sustanclalmente rota en ausencia de detergente de desoxicolato.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la membrana bacteriana es sustanclalmente rota en ausencia de cualquier detergente.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende las siguientes etapas básicas: (a) tratar células bacterianas en ausencia sustancial de detergente; (b) centrifugar la composición de la etapa (a) para separar las vesículas de las membranas externas de las células tratadas y el debris celular y recoger la materia sobranadante; (c) realizar una centrifugación a velocidad elevada de la materia sobrenadante de la etapa (b) y recoger las vesículas de membranas externas en un sedimento; (d) volver a dispersar el sedimento de la etapa (c) en un tampón; (e) realizar una segunda centrifugación a velocidad elevada de acuerdo con la etapa (c) recogiendo las vesículas de membranas externas en un sedimento; (f) volver a dispersar el sedimento de la etapa (e) en un medio acuoso.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente las siguientes etapas: (g) realizar una filtración estéril a través de al menos dos filtros de tamaño de poros decreciente de la composición nuevamente dispersada de la etapa (f); y (h) opcionalmente Incluir la composición de la etapa (g) en un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una composición adyuvante.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que la etapa (b) comprende una centrifugación a aproximadamente 5.000-10.000 g durante hasta 1 hora y las etapas (c) y (e) comprenden una centrifugación a aproximadamente 35.000-100.000 g durante hasta 2 horas.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la rotura de membranas es por aplicación de ultrasonidos, homogeneizaclón, mlcrofluldlzación, cavitación, choque osmótico, trituración, prensa francesa, combinación o cualquier otra técnica física.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tampón usado en la etapa (d) y/o en la etapa (f) es un tampón de Tris, un tampón de fosfato o un tampón de hlstldlna.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la etapa (g) finaliza con un filtro de tamaño de poros de aproximadamente 0,2 pin.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria a partir de la cual son preparadas las OMVs es del género Moraxella, Shigella, Pseudonconas, Treponema, Porphyromonas, Helicobacter o Neisseria.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la bacteria es N. meningitidis o N. gonorrhoeae.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la bacteria es N. meningitidis del serogrupo B.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la bacteria es cepa MC58, 2996, H4476 ó 394/98.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa de formular una cantidad inmunológicamente eficaz de las OMVs como una composición inmunógena.

14. Una composición de OMV, que puede ser obtenida mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

15. La composición de la reivindicación 14, comprendiendo adicionalmente un adyuvante.

16. La composición de la reivindicación 15, que comprende un adyuvante(s) de hidróxido y/o fosfato de aluminio.

17. la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, para ser usada como un medicamento.

18. El uso de una composición de vesículas de membranas externas de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la elaboración de un medicamento para hacer surgir una respuesta inmune en un paciente.