VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS MODIFICADO DE ANKARA (MVA), CON DELECIÓN EN EL GEN C6L, COMO VACUNAS CONTRA EL VIH/SIDA Y OTRAS ENFERMEDADES.

Vectores recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA),

con deleción en el gen C6L, como vacunas contra el VIH/SIDA y otras enfermedades.

La presente invención se engloba dentro de los campos de la biología molecular y de la biotecnología. Específicamente se refiere a virus recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) que expresan los antígenos gp120 y Gag-Pol-Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) de subtipo B (MVA-B), sobre los que se ha delecionado el gen de vaccinia C6L, y que han sido diseñados para utilizarse como vacunas contra el VIH/SIDA y otras enfermedades.

VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS MODIFICADO DE ANKARA (MVA) , CON DELECIÓN EN EL GEN C6L, COMO VACUNAS CONTRA EL VIH/SIDA y OTRAS ENFERMEDADES

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se engloba dentro de los campos de la biología molecular y de la biotecnología. Específicamente se refiere a virus recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) que expresan los antígenos gp120 Y Gag-Pol-Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) de subtipo B (MVA-B) , sobre los que se ha delecionado el gen de vaccinia C6L, y que han ,

sido diseñados para utilizarse como vacunas contra el VIH/SIDA y otras enfermedades.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Según datos de la OMS, el SIDA, causado por el VIH-1, es una pandemia que se expande mundialmente, con alto impacto y severidad en la salud humana. Cada año aumenta el número de nuevas infecciones y muertes causadas por el SIDA, sobre todo en los países no desarrollados o en vías de desarrollo. Por lo tanto, la búsqueda de una vacuna efectiva contra el VIH-1 que pueda controlar la infección y la progresión de la enfermedad es una de las prioridades en el ámbito científico.

Uno de los vectores más prometedores para ser utilizados como una vacuna efectiva frente a VIH-1 es MVA, una estirpe altamente atenuada de vaccinia (Esteban, 2009. Hum. Vaccin. 5:867-871) . MVA posee un excelente perfil de seguridad, y recombinantes de MVA que expresan antígenos de VIH-1 inducen protección después de un desafío con el virus de la inmunodeficiencia simia/humana (SHIV) , generando respuestas inmunes fuertes, amplias, polifuncionales y duraderas frente a antígenos de VIH-1 en diferentes modelos animales y ensayos clínicos en humanos (García-Arriaza et aL, 2010. PLoS One 5: e12395; Gómez et aL, 2009. Vaccine 27: 3165-3174; Harari et aL, 2008. J Exp Med 205: 63-77; Mooij et aL, 2008. J Virol 82: 2975-2988; Gómez et aL, 2007.

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Vaccine 25: 2863-2885; Gómez et aL, 2007. Vaccine 25: 1969-1992; resumen en Gómez et aL, 2008. Curr Gene Ther 8: 97-120) .

Previamente se ha construido en nuestro laboratorio un recombinante de MVA que expresa los antígenos de VIH-1 de subtipo B, gp120 (SEQ ID No 15 de PCT/ES2006/070114) como una proteína monomérica y la poliproteína Gag-Pol-Nef (SEQ ID No 16 de PCT/ES2006/070114) (virus denominado MVA-B) (Patente: PCT/ES2006/070114, fecha de publicación: 1/2/2007. Autores: Heeney, Jonathan; Mooij, Petra; Gómez Rodríguez, Carmen Elena; Nájera García, José Luis; Jiménez Tentor, Victoria; Esteban Rodríguez, Mariano) . En un protocolo de inmunización "DNA prime/MVA boost" en ratones MVA-B indujo fuertes respuestas inmunes frente a los antígenos de VIH-1 (García-Arriaza et aL, 2010. PLoS One 5: e12395; Gómez et aL, 2009. Vaccine 27: 3165-3174; Gómez et aL, 2007. Vaccine 25: 2863-2885) . En macacos, una construcción similar que expresa Env (gp120 de SHIVs9.6P) y Gag-Pol-Nef (de SIVmac239) mostró fuertes respuestas inmunes específicas de células T CD4+ y CD8+ con una preferencia por CD8+, y una alta protección después de un desafío con SHIVs9.6P (Mooij et aL, 2008. J Virol

82: 2975-2988) . Además, la expresión de antígenos de VIH-1 por parte de MVA-B induce de forma selectiva en células dendríticas humanas la expresión de diferentes genes celulares que pueden actuar como reguladores de las respuestas inmunes frente a los antígenos de VIH-1 (Guerra et aL, 2010. J Virol

84: 8141-8152) . Basado en todos estos resultados previos, se ha realizado en España un ensayo clínico de Fase I con MVA-B en voluntarios sanos.

Sin embargo, a pesar de todos estos antecedentes, son necesarios y deseables nuevos vectores poxvirales MVA-B más eficientes que puedan aumentar la magnitud, amplitud, polifuncionalidad y durabilidad de las respuestas inmunes frente a los antígenos de VIH-1. Esto es particularmente relevante cuando un solo inmunógeno es deseable para los propósitos de vacunación en masa para simplificar los protocolos de inmunización y reducir los costes de fabricación. Los vectores poxvirales expresan numerosos genes que codifican para proteínas inmunomoduladoras que interfieren con la respuesta anti-viral del hospedador (Alcamí, 2003. Nat. Rev. Immunol. 3:36-50) . Por lo tanto, la deleción en el vector poxviral MVA-B de genes de vaccinia que se conocen o sugieren que puedan tener una función inmunomoduladora, es una estrategia general que puede aumentar la inmunogenicidad del vector frente a los antígenos de VIH-1.

Uno de estos genes cuya función se desconoce pero que pensamos puede tener función inmunomoduladora es el gen de vaccinia C6L, el cual está presente en el genoma de las estirpes de vaccinia MVA (gen denominado MVA 019L, SEQ ID No: 1) , Western Reserve (WR) (gen denominado VACV-WR_022, SEQ ID No: 3) , Y Copenhagen (gen denominado C6L, SEQ ID No: 5) , pero ausente en la estirpe New York Vaccinia Virus (NYVAC) . Se postula que C6L es un gen inmediato-temprano, según el análisis del promotor de C6L y el análisis del transcriptoma que detecta ARN mensajero de C6 a los 30 minutos post-infección (Assarsson et aL, 2008. P.N.A.S. 105: 2140-2145) . C6L codifica una proteína de 157 aminoácidos con un peso molecular predicho de 18.2 kDa. Análisis bioinformáticos, sin datos experimentales, han agrupado C6L en la familia de genes poxvirales denominada "BCL-2-like", que incluye A46R, A52R, B15R (denominado B14R en WR) y K7R (González y Esteban, 2010. Virol. J. 7:59) , una familia de proteínas que inhiben a diferentes niveles la ruta de señalización mediada por "TolI-like receptor (TLR) " (Bowie et aL, ﾭ10167; Che n et aL, 2006. J. Gen. Virol. 87:1451-1458; Chen et aL, 2008. PloS Pathog. 4:e22; Graham et aL, 2008. PloS Pathog. 4:e1000128; Harte et aL, 2003.

J. Exp. Med. 197:343-351; Kalverda et aL, 2009. J. Mol. Biol. 385:843-853; Oda et aL, 2009. Structure 17:1528-1537; Schroder et aL, 2008. EMBO J. 27:2147-2157; Stack et aL, 2005. J. Exp. Med. 201:1007-1018) . La proteína C6 está presente, aunque a bajos niveles, en los viriones maduros intracelulares de vaccinia (IMV) (Chung et aL, 2006. J. Viro1. 80:2127-2140) , y se une a las proteínas KRT4 (queratina 4) , PDCD61P y TNNI2 (troponina 1) (Zhang et aL, 2009. J. Proteome Res. 8:4311-4318) . Además, un epítopo de C6 (aminoácidos 74-82 de SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 3) es altamente inmunogénico en ratones BALB/c, y WR induce en ratones altos niveles de células secretoras de IFN-y específicas para C6L, de forma similar a péptidos de vaccinia de E3L, F2L YA52R (Oseroff et aL, 2008. J. Immunol. 180:7193-7202) . Todas estas características nos indican que C6 puede tener una importante función inmunomoduladora antagonizando con la ruta de señalización TLR. Por lo tanto, en esta invención se ha generado un nuevo candidato vacunal frente a VIH-1, denominado MVA-B ~C6L, el cual contiene una deleción en el vector MVA-B del gen de vaccinia C6L y que demostramos actúa induciendo la producción de interferón tipo 1 y activando in vivo la producción de células T de memoria, lo que no era de esperar, pero que representa una atractiva alternativa para incrementar la inmunogenicidad de candidatos vacunales basados en MVA.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención representa un ﾭ1, denominado MVA-B i1C6L, el cual contiene una deleción en el vector MVA-B del gen de vaccinia C6L. MVA-B i1C6L replica en cultivos celulares al mismo nivel que el virus parental MVA-B, indicando que C6 no es esencial para la replicación viral. De forma adicional, MVA-B i1C6L induce respuestas inmunes innatas incrementando la expresión de IFN-/3 y genes inducidos por IFN-a//3 (IFIT1 e IFIT2) en células humanas THP-1 y células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs) , sugiriendo que C6 inhibe la ruta de señalización de IFN-/3 bloqueando algún componente desconocido involucrado en la inducción de IFN-/3. La deleción del gen C6L en el vector MVA-B aumenta en ratones la respuesta inmune humoral y de células T de memoria frente a los antígenos de VIH-1. Así, mediante un protocolo de inmunización "DNA prime/MVA boost" en ratones se mostró que, comparado con MVA-B, MVA-B i1C6L aumenta significativamente la magnitud y polifuncionalidad de la respuesta inmune de células T de memoria CD4+ y CD8+ específicas frente a VIH-1, la cual está mediada principalmente por células T CD8+ de fenotipo efector, en ambos grupos de inmunización. La respuesta de células T de memoria CD4+ específicas frente a VIH-1, inducidas por MVA-B y MVA-B i1C6L fue preferencialmente específica frente a Env. Sin embargo, mientras que MVA-B induce respuestas inmunes de células T de memoria CD8+ específicas frente a Env y Gag, MVA-B ~C6L induce preferencialmente respuestas inmunes de células T de...

1. Un vector viral basado en un virus recombinante MVA, caracterizado por

que la secuencia nucleotídica codificante para dicho vector comprende: a) al menos una mutación en la secuencia SEO ID No: 1 que codifica para la proteína C6L, y b) al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno heterólogo.

2. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 1, caracterizado por que la mutación en la secuencia SEO ID No: 1 es una deleción parcial o total.

3. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 2, caracterizado por que la mutación en la secuencia SEO ID No: 1 es una deleción total.

4. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que la secuencia nucleotídica codificante para dicho vector comprende al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno heterólogo seleccionado de entre el siguiente grupo: antígeno del VIH, antígeno de la malaria, antígeno de la leishmaniosis, antígeno del virus de la hepatitis C y antígeno del cáncer de próstata.

5. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que la secuencia nucleotídica codificante para dicho vector comprende las secuencias nucleotídicas que codifican para los siguientes antígenos del VIH: antígenos gp120 y Gag-Pol-Nef de VIH de subtipo B, o de cualquier otro subtipo, bajo el control del promotor sintético viral temprano/tardío insertado dentro dellocus viral TK.

6. Método de fabricación del vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5, caracterizado por comprender las siguientes etapas:

a) construir un plásmido que comprende en su secuencia nucleotídica las secuencias del flanco derecho y del flanco izquierdo de SEQ ID No: 1, b)

recombinar un virus recombinante MVA, que contiene al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno heterólogo, con el

plásmido generado en a) el cual dirige la mutación de SEQ ID No: 1, y

c) purificar el vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5, obtenido en el paso b) .

7. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5 en la fabricación de un medicamento o composición inmunogénica para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de próstata.

8. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 7, caracterizado por que dicho medicamento o composición inmunogénica es para prevenir o tratar la enfermedad del VIH.

9. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5 en la fabricación de un medicamento o composición inmunogenrca para usar como parte de un protocolo de inmunización para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de próstata, en el que se administra al individuo al menos una dosis de vacunación.

10. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 9 caracterizado por que dicho medicamento o composición inmunogénica se administra al individuo al menos una dosis de vacunación para:

a) inducir una respuesta inmune de células T e04+ y e08+ de memoria antígeno específicas, y/o b) para inducir la expresión de IFN-~ en células inmunes innatas.

11. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 10, caracterizado por que dicho medicamento o composición inmunogénica se usa como parte de un protocolo de inmunización en el que se

administra al individuo al menos una dosis de vacunación, para prevenir o tratar la enfermedad del VIH.

12. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 10, caracterizado por que dicho medicamento o composición inmunogénica se usa como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra al individuo al menos una dosis de vacunación de una combinación de vectores heterólogos para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de próstata.

13. Una composlclon inmunogénica caracterizada por que comprende al menos un vector viral definido en las reivindicaciones 1-5.

14. Uso de la composición inmunogénica definida en la reivindicación 13, en la

fabricación de una vacuna para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de próstata.

15. Uso de la composición inmunogenrca según la reivindicación 14, caracterizada por que dicha vacuna es para prevenir o tratar el VIH.