Vectores novedosos para células animales y uso de los mismos.

Procedimiento para producir una proteína, caracterizado por cultivar células transformadas que comprendenuna célula animal que contiene un vector de expresión que contiene un gen de resistencia a inhibidor de síntesis deproteínas de los siguientes (i) o (ii) y un gen estructural de proteína foránea en estado expresable y recoger laproteína foránea expresada,



(i) que puede conferir resistencia a cicloheximida como inhibidor de síntesis de proteínas a células animalesderivadas de un mamífero sensible al inhibidor y codifica para una secuencia de aminoácidos tal como se codificapor el ADN de SEQ ID NO: 1, o

(ii) que puede conferir resistencia a cicloheximida como inhibidor de síntesis de proteínas a células animalesderivadas de un mamífero sensible al inhibidor y codifica para una proteína homóloga al 90% o más a una proteínatal como se describió en (i) y en el que el aminoácido correspondiente a la posición 54 tal como se codifica por elADN de SEQ ID NO: 1 es glutamina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2002/002201.

Solicitante: KYOWA HAKKO KIRIN CO., LTD..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-6-1, OHTEMACHI, CHIYODA-KU TOKYO 100-8185 JAPON.

Inventor/es: MISAWA,ELISA, YAJIMA,H, KONDO,K.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/65 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › utilizando marcadores (enzimas empleados como marcadores C12N 15/52).

PDF original: ES-2403931_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Vectores novedosos para células animales y uso de los mismos

Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para producir proteínas y similares usando vectores de expresión recombinantes, particularmente a una técnica para seleccionar células, en las que se ha transferido un gen de manera estable, usando un gen resistente a fármaco novedoso como marcador de selección, y a una técnica para obtener eficazmente células en las que un gen se expresa altamente.

Técnica anterior

<Técnicas de producción de proteínas recombinantes>

Se ha vuelto posible producir una variedad de proteínas útiles, incluyendo las que se producen en una cantidad extremadamente pequeña en un organismo o que tienen una estabilidad demasiado baja como para purificarse, mediante la evolución de las técnicas de expresión recombinante de un gen. El uso de tales técnicas ha hecho posible no sólo el uso práctico de muchas proteínas recombinantes como productos farmacéuticos o enzimas industriales, sino también la elucidación de las estereoestructuras de proteínas o el análisis de las interacciones entre proteínas, y por tanto el entendimiento de la vida ha avanzado considerablemente. Además, ha sido posible obtener genes útiles mediante el avance considerable de los estudios del genoma en muchas especies biológicas, incluyendo el ser humano, y el desarrollo de tecnologías de PCR y bioinformática. Por tanto, al contrario que las situaciones convencionales en las que la clonación de genes ha sido con frecuencia el factor determinante de la velocidad de los estudios, ahora se ha requerido una gran cantidad de tiempo para desarrollar la expresión estable de un gen clonado, es decir, el procedimiento para producir una proteína codificada por el gen y en una gran cantidad.

Los huéspedes usados para la producción de proteínas recombinantes incluyen Escherichia coli, levadura, células derivadas de insectos y mamíferos, pero aún no se han desarrollado huéspedes universales para producir proteínas que satisfagan todas las necesidades. Por tanto, incluso ahora debe llevarse a cabo un proceso de ensayo y error para la construcción de sistemas de producción para cada proteína pretendida. A modo de ejemplo, aunque Escherichia coli es el sistema de expresión usado más popularmente, está en tela de juicio para la producción de proteínas que tienen actividades en las que las proteínas producidas con frecuencia forman cuerpos de inclusión insolubles y la modificación postraduccional tal como glicosilación se produce escasamente al contrario que en eucariotas. Además, también se usan sistemas de expresión en los que se usan eucariotas tales como levaduras u hongos como huéspedes, pero estos sistemas no siempre son eficaces con todas las proteínas y con frecuencia es difícil llevar a cabo la expresión de las actividades o la compleja modificación postraduccional de proteínas derivadas de animales que tienen estructuras complejas. Además, recientemente se ha usado con frecuencia un sistema de expresión con baculovirus y células de insecto como célula huésped. Este sistema tiene muchas ventajas porque la proteína producida se ha sometido a modificaciones postraduccionales tales como fosforilación y glicosilación y por tanto puede expresarse manteniendo las actividades fisiológicas originales, pero la estructura de la cadena de azúcar de la proteína secretada es diferente de la de las células derivadas de mamíferos, de modo que se producirán problemas tales como la antigenicidad de las proteínas recombinantes en aplicaciones farmacéuticas.

Por otro lado, es mejor seleccionar un sistema de expresión con un organismo relacionado con aquél del que se deriva una proteína diana con el fin de producir la proteína en el mismo estado que in vivo, es decir, en el mismo estado con respecto a la estereoestructura de la proteína mantenida en un organismo y las modificaciones postraduccionales tales como fosforilación, glicosilación y truncamiento. Por tanto, se ha usado predominantemente un sistema de expresión que tiene las células derivadas de mamíferos como huésped en la expresión de una proteína que se deriva de animales, en caso de que se requieran las modificaciones postraduccionales tales como glicosilación para mantener la actividad de la proteína, la proteína tenga una estructura complicada o no se hayan identificado las funciones de la proteína. El sistema de expresión con células animales es ventajoso porque la proteína puede someterse a una modificación postraduccional precisa, y por tanto puede esperarse un plegamiento apropiado para ejercer sus actividades. Por tanto, se afirma que es el sistema más apropiado para el fin de análisis bioquímico y análisis funcional de proteínas derivadas de animales.

La expresión se clasifica en dos tipos, el método de expresión transitoria en el que un gen se expresa transitoriamente, y el método de expresión estable en el que se preparan células que expresan constantemente un gen. En el método de expresión transitoria, el gen transferido se transcribe y se traduce en las células, y la expresión de una proteína se observa tras varias horas desde la transferencia y alcanza su máximo tras dos o tres días. Se emplea un método para amplificar el número de copias de un plásmido que contiene ori de SV40 transfiriendo el plásmido en células tales como células COS, en las que se expresa el gen de antígeno T grande de SV40, con el fin de aumentar la cantidad de producción de la proteína, pero requiere la transferencia del plásmido en células cada vez y por tanto la cantidad de la proteína producida mediante este método es limitada. Por otro lado, cuando es necesario realizar el análisis con las células en las que la proteína diana se ha expresado constantemente o producir la proteína diana en una determinada cantidad, se selecciona el método de expresión estable en el que el gen transferido se inserta en el cromosoma de las células. Si se ha establecido en absoluto una línea celular recombinante que tiene una alta productividad de proteína de interés, todas las células han expresado el gen diana, de modo que puede realizarse una variedad de análisis y también puede llevarse a cabo el cultivo a gran escala con el fin de producir una proteína recombinante homogénea. Sin embargo, dado que la cantidad de expresión génica varía ampliamente entre las líneas celulares recombinantes debido a las copias del gen insertado en el cromosoma de la célula o la posición del cromosoma en la que se ha insertado el gen, debe seleccionarse una línea celular que tiene una alta cantidad de expresión que puede usarse para el análisis o la producción. Sin embargo, la mayoría de los clones de células transformadas tienen cantidades de expresión extremadamente bajas, y por tanto la selección del clon con alta expresión requiere operaciones laboriosas y que requieren mucho tiempo.

Tal como se describió anteriormente, en cualquier caso de producción de una proteína en cualquiera de las formas de expresión, se han tratado diversas ideas para solucionar el problema de que las cantidades de producción de proteínas en células animales siguen estando generalmente a niveles inferiores en comparación con los de otros sistemas de huésped de expresión recombinante.

<Aumento del nivel de expresión de un gen>

El nivel de expresión de un gen eucariota transferido en células animales se regula mediante diversos factores tales como una secuencia de ADN que actúa en cis sobre la expresión del gen o el factor regulador de la transcripción que actúa en trans sobre la secuencia de ADN, el número de copias del gen, el sitio de inserción del gen transferido en el cromosoma y la estabilidad del ARNm (Dillon y Grosveld, Trends Genet., 9:134, 1993) . El sistema regulador se ha analizado hasta el momento desde muchos aspectos y se han desarrollado vectores de plásmido para obtener cepas celulares en las que se expresa altamente un gen basándose en estos resultados (Makrides S. C.; 1999) . Ahora se describe a continuación información típica.

Los factores que actúan en cis que participan en la regulación de la expresión génica son secuencias de ADN, de las cuales las típicas incluyen secuencia promotora y secuencia potenciadora. Se ha examinado exhaustivamente que una variedad de proteínas reguladoras de la transcripción que regulan la transcripción actúan como factores que actúan en trans en cualquiera de las secuencias. La secuencia promotora está adyacente al sentido 5’ del gen y contiene una región esencial para la transcripción básica. La secuencia potenciadora puede estar presente en un lugar alejado del gen o en un intrón, y la orientación de la secuencia no es fija. Además,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para producir una proteína, caracterizado por cultivar células transformadas que comprenden una célula animal que contiene un vector de expresión que contiene un gen de resistencia a inhibidor de síntesis de proteínas de los siguientes (i) o (ii) y un gen estructural de proteína foránea en estado expresable y recoger la proteína foránea expresada,

(i) que puede conferir resistencia a cicloheximida como inhibidor de síntesis de proteínas a células animales derivadas de un mamífero sensible al inhibidor y codifica para una secuencia de aminoácidos tal como se codifica 10 por el ADN de SEQ ID NO: 1, o

(ii) que puede conferir resistencia a cicloheximida como inhibidor de síntesis de proteínas a células animales derivadas de un mamífero sensible al inhibidor y codifica para una proteína homóloga al 90% o más a una proteína tal como se describió en (i) y en el que el aminoácido correspondiente a la posición 54 tal como se codifica por el

ADN de SEQ ID NO: 1 es glutamina.


 

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