Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus.

Un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácido nucleico de interés en células de mamífero, comprendiendo el vector una primera secuencia quimérica reguladora de promotor que está unida operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, en donde la secuencia quimérica reguladora de promotor comprende:

(i) una secuencia promotora del promotor IE1 de citomegalovirus murino y que está unida operativamente al sitio de inicio de la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar; y

(ii) una secuencia amplificadora de la región IE1 de citomegalovirus humano y/o de simio, estando localizada la secuencia amplificadora 5' y unida operativamente a la secuencia promotora IE1 de citomegalovirus murino; y en donde la secuencia quimérica reguladora de promotor comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12185728.

Solicitante: LONZA BIOLOGICS PLC.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 228-230 Bath Road SloughSL1 4DX REINO UNIDO.

Inventor/es: YOUNG, ROBERT, PAYNE,TOM, FEARY,MARC.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/85 (para células animales)

PDF original: ES-2540753_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas de expresión de mamífero, y en particular a construcciones de expresión que comprenden secuencias reguladoras quiméricas para la expresión heteróloga de una secuencia de ácido nucleico de interés en células de mamífero. Las secuencias reguladoras del promotor quiméricas están compuestas por una secuencia de promotor del promotor IE1 de citomegalovirus murino y una secuencia de amplificador de la región IE1 del citomegalovirus humano y/o de simio.

Antecedentes

Los (poli)péptidos y proteínas recombinantes para aplicaciones en investigación básica, diagnóstico y terapia, tales como moléculas de anticuerpos, vacunas, hormonas, y factores de crecimiento, se producen utilizando una amplia variedad de organismos modificados genéticamente que incluyen tanto células procariotas como eucariotas. Sin embargo, la inmensa mayoría de péptidos o proteínas recombinantes incluyen modificaciones pos-traduccionales que no se pueden imitar o reproducir cuando se utilizan células huésped procariotas. Por esta razón, los sistemas de expresión genética de mamíferos han terminado representando la elección preferida.

Los sistemas de expresión en mamíferos que se basan en células ováricas de hámster (CHO) se utilizan ampliamente en la producción de proteínas recombinantes. Además de las líneas celulares linfoides, las células CHO representan uno de los pocos tipos celulares que permiten un cultivo discontinuo en suspensión de alta densidad simple y eficaz de células animales. Además, el uso de células CHO da como resultado rendimientos de producto muy altos, mientras que las células linfoides son más difíciles de cultivar a escala industrial. En vista de los costes considerables de la producción recombinante de polipéptidos y proteínas, es de la máxima importancia maximizar el rendimiento de proteína recombinante por proceso del biorreactor. Los parámetros del proceso que tienen un impacto considerable en el rendimiento de la producción incluyen Ínter alia las condiciones de cultivo celular, el número de copias de los ácidos nucleicos (genes) que se van a expresar, la eficacia con la que se transcriben estos genes y se traducen los ARNm correspondientes, la estabilidad del ARNm, y similares.

En consecuencia, las mejoras en la potencia o actividad de la transcripción de los elementos genéticos reguladores que controlan la expresión genética constituyen un factor particularmente crítico con el fin de aumentar el rendimiento de la proteína recombinante que se produce. Incluso pequeños aumentos crecientes de la actividad de transcripción a nivel de una única célula se traducirá finalmente en mejoras considerables del rendimiento de producto en cultivos discontinuos de alta densidad a escala industrial.

La inmensa mayoría de los sistemas de expresión genética de mamífero emplean vectores de expresión que codifican secuencias de ácido nucleico heterólogas que se van a expresar bajo el control de secuencias reguladores que derivan de un virus. Dos de los elementos reguladores víricos que se utilizan más frecuentemente en estos casetes de expresión son los genes inmediatos tempranos 1 y 2 (IE1 e IE2) de citomegalovirus humano (hCMV). Sin embargo, una desventaja que se asocia con el uso de los elementos reguladores IE1 e IE2 de hCMV es su pronunciada especificidad de especie.

La patente de EE. UU. 5.866.359 desvela que la expresión genética de tal promotor hCMV puede mejorarse con la co-expresión de proteína EIA adenovírica bajo el control de un promotor débil. La EIA es un factor de transcripción multifuncional que puede actuar en la regulación del ciclo celular y tiene dominios funcionales independientes tanto de activación como de represión de la transcripción. El ajuste preciso de la expresión de EIA es crucial para conseguir el equilibrio ideal entre la transactivación genética y cualquier impacto negativo sobre la progresión del ciclo celular. Sin embargo, la sobre-expresión de la expresión de EIA podría reducir la capacidad de la célula para sintetizar la proteína recombinante de interés.

La patente de EE. UU 5.591.639 describe vectores que comprenden, corriente arriba (5) de la secuencia de ácido nucleico heteróloga que se va a expresar, el amplificador, promotor, y región completa 5 sin traducir del gen inmediato temprano principal del citomegalovirus humano (hCMV-MIE) que incluye el intrón A (es decir, el primer intrón natural). Sin embargo, si estaban presentes los primeros 400 pb (extremo 5) de esta secuencia (de longitud total 2100 pb), se observaban tasas bajas de expresión genética tanto en células COS7 como en CHO (Chapman, B.S. et al. (1991) Nucí. Acids Res. 19, 3979-3986).

La actividad de transcripción de los elementos reguladores de los genes inmediatos tempranos del citomegalovirus murino (mCMV) es mayor que los equivalentes del hCMV sin que manifieste la pronunciada preferencia por especies que se observa en las secuencias humanas (Addison, C.L. et al. (1987) J. Gen. Viral. 78. 1653-1661). La publicación de patente internacional WO 2004/081167 desvela vectores de expresión que comprenden el promotor IE2 de mCMV que se puede utilizaren combinación con un elemento amplificador IE2 de CMV. Se han descrito vectores de expresión para la expresión simultánea de proteína dual de alto nivel en células de vertebrados e insectos que

emplean elementos de promotor y amplificador de IE1 de mCMV en combinación con una construcción de promotor de baculovirus por Keil y sus colaboradores (Keil, G.M. et al. (2009) J. Viro/. Meth. 160, 132-137). Finalmente, se desvelan construcciones quiméricas de promotor que comprenden secuencias de promotor y amplificador, cada una de ellas de genes IE de citomegalovirus humano, murino o de simio, en la solicitud de patente europea 0 214 161.

Sin embargo, los intentos para aumentar la actividad de los elementos reguladores del promotor IE de mCMV, análogamente a los equivalentes del hCMV, mediante la inserción del primer intrón natural del gen inmediato temprano principal murino corriente abajo (3) del promotor IE de mCMV no funcionaron (cf, ínter alia en patente EP 1 525 320 B1). Sin embargo, la generación de vectores de expresión que comprendían un casete quimérico compuesto por los elementos reguladores IE de mCMV y el primer intrón natural del gen inmediato temprano principal humano daba como resultado rendimientos en producto comparables con el uso de las secuencias completamente humanas (cf., por ejemplo, WO 2006/111387 A2). Se obtenían también tasas de expresión genética similares con vectores de expresión que comprendían las secuencias reguladoras IE2 de mCMV (cf. ínter alia la patente EP 1 601 776 B1).

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas de expresión de mamífero mejorados que tengan altos rendimientos de los polipéptidos o proteínas recombinantes que se producen. En particular, existe la necesidad de sistemas de expresión genética de mamífero que superen las limitaciones mencionadas anteriormente, es decir, sistemas de expresión que se basen en secuencias de promotor del mCMV (debido a su menor especificidad de especie) pero que alcancen mayores tasas de expresión (y por tanto de rendimientos de producto) que con el sistema disponible.

En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar tales sistemas de expresión genética, construcciones de expresión adecuadas primariamente y las correspondientes células huésped de mamífero.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión para la expresión heteróloga... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácido nucleico de interés en células de mamífero, comprendiendo el vector una primera secuencia quimérica reguladora de promotor que está unida operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, en donde la secuencia quimérica reguladora de promotor comprende:

(i) una secuencia promotora del promotor IE1 de citomegalovirus murino y que está unida operativamente al sitio de inicio de la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar; y

(ii) una secuencia amplificadora de la región IE1 de citomegalovirus humano y/o de simio, estando localizada la secuencia amplificadora 5 y unida operativamente a la secuencia promotora IE1 de citomegalovirus murino; y

en donde la secuencia quimérica reguladora de promotor comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en la SEC ID N(i) 2 7, SEC ID N2 9 y SEC ID N210.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, que comprende además una segunda secuencia quimérica reguladora de promotor que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, en donde la segunda secuencia quimérica reguladora de promotor es idéntica a la primera secuencia quimérica reguladora de promotor.

3. El vector de expresión de la reivindicación 1, que comprende además una segunda secuencia quimérica reguladora de promotor que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, en donde la segunda secuencia quimérica reguladora de promotor es diferente de la primera secuencia quimérica reguladora de promotor.

4. El vector de expresión de las reivindicaciones 2 o 3, en donde la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico que se van a expresar codifican polipéptidos diferentes.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en donde los polipéptidos diferentes representan subunidades de una proteína dimérica o multimérica.

6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en donde la proteína dimérica o multimérica es una molécula de anticuerpo.

7. Una célula huésped de mamífero que se transfecta con un vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. La célula huésped de mamífero de la reivindicación 7, en donde la célula huésped es una célula CHO.

9. Un método para la expresión heteróloga de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula huésped de mamífero, que comprende:

(i) transfectar la célula huésped de mamífero con un vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(ii) cultivar la célula huésped de mamífero transfectada bajo condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico de interés.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la transfección es una transfección estable.

11. Uso de un vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la expresión heteróloga in vitro de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula huésped de mamífero.