VECTOR PARA SILENCIACION GENICA Y METODO DE SILENCIACION GENICA QUE LO UTILIZA.
Uso de un vector de silenciamiento génico para silenciar un gen diana en una planta hospedadora,
donde dicho vector de silenciamiento génico comprende:
un vector recombinante que incluye
un promotor,
una secuencia líder de ARN4 del virus del mosaico del pepino curso abajo del promotor,
un gen que codifica una proteína de cubierta de una cepa del virus Y de la necrosis de patata (PVY-N) que está curso abajo de la secuencia líder, y
un terminador que está curso abajo del gen,
donde, con el fin de causar silenciamiento génico del gen diana específico en una planta hospedadora, una construcción génica que comprende un promotor, una secuencia del gen diana y un terminador es insertada curso abajo del terminador del vector
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP03/06328.
Solicitante: JAPAN TOBACCO INC..
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 2-1, TORANOMON 2-CHOME, MINATO-KU,TOKYO 105-8422.
Inventor/es: KASAOKA, KEISUKE, JAPAN TOBACCO INC., SAITO,YASUHITO,JAPAN TOBACCO INC, KUWATA,SHIGERU,LAB. OF PLANT BIOTECHNOLOGY.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 18 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/82B
- C12N15/82B4
Clasificación PCT:
- C12N15/33 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas virales.
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Vector para silenciación génica y método de silenciación génica que lo utiliza.
Campo técnico
La presente invención se refiere al uso de un vector viral para causar el silenciamiento génico (llamado vector de silenciamiento génico aquí en lo sucesivo) y a un método de silenciamiento génico usando el vector. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método de silenciamiento génico del tipo inducido por virus, que exhibe una alta probabilidad de incidencia de silenciamiento génico y que es hereditario según las leyes de Mendel.
Técnica anterior
La supresión de la expresión de un gen diana específico es una técnica prometedora no sólo en el aspecto de investigación con el propósito del análisis de las funciones génicas sino también para el cultivo de plantas. Como medio para ese propósito, se conoce un método antisentido, que introduce un ADN antisentido que tiene una secuencia de bases cuya dirección es opuesta a la dirección del gen diana dentro de una célula para inhibir la traducción del gen diana. Sin embargo, el método antisentido tiene el problema de que es difícil la inhibición completa de la producción de la proteína.
Para resolver el problema arriba mencionado implicado en el método antisentido, recientemente se han aumentado los estudios de silenciamiento génico. Los silenciamientos génicos se clasifican en, uno que actúa a nivel de la transcripción de un gen (Silenciamiento Génico Transcripcional; TGS por sus siglas en inglés) y uno que actúa tras la transcripción (Silenciamiento Génico Postranscripcional; PTGS). Ambos difieren del método antisentido en que, en muchos casos, se da frecuentemente la supresión de la expresión de genes endógenos cercana a un intervalo del 100%. Recientemente, ha habido muchos trabajos de investigación en PTGS; el fenómeno de la rápida descomposición de ARNm transcrito se describe en los mamíferos, plantas y microorganismos (SCIENCE vol. 288, 1370-1372; NATURE vol. 404, 804-808; etc.). Aunque el mecanismo de PTGS actualmente es desconocido, el fenómeno se conoce como Co-supresión en el campo de la biotecnología vegetal.
Sin embargo, el problema ha sido indicado en que la co-supresión exhibe una baja probabilidad de incidencia de PTGS, y que se observa frecuentemente para la inducción de PTGS que ocurre sólo en una porción del tejido.
Además, se conoce el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) que usa un vector viral con el fin de inducir eficazmente PTGS. Sin embargo, VIGS tiene los problemas que implican el uso de virus per se como un vector y que el silenciamiento génico no se hereda.
Los inventores de la presente invención previamente han descrito en el documento JP 6-133783, un vector para impartir a las células de patata resistencia a la cepa de necrosis del virus Y de la patata (PVY-N). Los estudios posteriores se han dirigido al descubrimiento de que el vector puede ser usado para silenciamiento génico y completar la presente invención. Esto es, la presente invención consiste en proporcionar el uso de un vector de silenciamiento génico que suprime la expresión de un gen diana específico en un hospedador.
Descripción de la invención
Un vector de silenciamiento génico usado según la presente invención es un vector recombinante que comprende una secuencia potenciadora curso abajo del promotor y un gen que codifica una proteína de cubierta de origen potyvirus (en adelante, denominada ocasionalmente como gen codificante de CP
) curso abajo del gen que codifica CP, donde es usada una construcción génica diana específica que comprende un promotor, una secuencia del gen diana y un terminador insertado curso abajo del terminador del vector.
Además, el método de silenciamiento génico según la presente invención comprende transformar una planta hospedadora con una construcción génica obtenida insertando el gen diana dentro del vector, suprimiendo así la expresión del gen diana en la planta hospedadora.
El vector de silenciamiento génico según la presente invención o el método de silenciamiento génico según la presente invención da aproximadamente efectos inesperados tales que:
(1) la alta probabilidad de incidencia del silenciamiento génico puede proporcionarse incluso cuando sólo hay una copia del gen diana;
(2) se pueden proporcionar individuos en los que la expresión del gen diana está controlada a varios niveles (suprimida en un intervalo de varios % a 100%) en la presente generación;
(3) el silenciamiento génico puede ser heredado en la progenie; y
(4) se pueden proporcionar variedades en las que la expresión del gen diana es suprimida en un intervalo de varios % a 100% cruzando con una variedad fija, debido a que el silenciamiento génico se hereda conforme a las leyes de Mendel.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es un diagrama que ilustra la construcción del vector PVY-T/CPW.
La Fig. 2 es un diagrama que ilustra la construcción del vector pYS415.
La Fig. 3 es un diagrama que ilustra la construcción del vector pYS412.
La Fig. 4 es un diagrama que ilustra la construcción del vector pYS436.
Las Figs. 5A y 5B son diagramas que ilustra la construcción del vector pYS465.
La Fig. 6 es un diagrama que ilustra la construcción del vector pYS466.
En aquellos diagramas, los símbolos de los mismos son como sigue:
NPT = neomicina fosfotransferasa, BR = borde derecho, BL = borde izquierdo, 35s-pro = promotor 35s del virus del mosaico de la coliflor, NOS-ter = terminador de la nopalina sintetasa, Amp = gen de resistencia a ampicilina, PVY-CP = gen de la proteína de cubierta de PVY-T, GFP = gen GFP, GUS = gen de la ß-glucuronidasa, y PsDof1 = factores de transcripción del deflector de zinc de guisante.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Más adelante, la invención se describirá en detalle.
Los inventores de la presente invención observaron que, en un vector GS-PVY (JP 6-133783 A) desarrollado con el fin de hacer la patata resistente a una línea de necrosis del virus Y de la patata, un gen incorporado alrededor de una proteína de cubierta PVY-T en una dirección sentido es inducido para causar silenciamiento génico en un hospedador, y encontraron que existe un gen que codifica un potenciador y un gen que codifica una proteína de cubierta de origen viral curso abajo de un promotor profundamente relacionado con PTGS.
El vector GS-PVY es un vector recombinante que tiene una secuencia líder del ARN4 del virus del mosaico del pepino (CMV) curso abajo de un promotor y un gen que codifica una proteína de cubierta de la cepa de necrosis del virus Y de la patata (PVY-N) curso abajo de la secuencia líder.
El promotor usado en el vector de silenciamiento génico no está particularmente limitado, sino que puede ser uno cualquiera, con tal de que pueda iniciar la transcripción de la proteína de cubierta de origen viral. Por ejemplo, se pueden utilizar el promotor 35S, el promotor PAL, el promotor PAL BOX.
La secuencia líder del ARN 4 en CMV se muestra en Nitta et al., Japanese Journal of Phytopathology 54: 516-522 (1988). Además, se conoce bien que la secuencia líder de una proteína estructural de un virus vegetal generalmente tiene un efecto de potenciación de la expresión de proteínas (D.E. Sleat y T.M.A Wilson, 1992, Plant Virus Genomes as Source of Novel functions for Genetic Engineering, en Genetic Engineering with Plant Viruses, T.M.A. Wilson y J.W. Davies ed., CRC Press, págs. 55-113).
Por ello, en el vector de silenciamiento génico, no está limitada la secuencia líder del ARN 4 de CMV localizada curso abajo del promotor del vector GS-PVY, sino que puede ser cualquier secuencia potenciadora con tal de que pueda activar la transcripción de la expresión de la proteína; por ejemplo, un potenciador en el promotor 35S (una región de -90 a -440) o se puede usar una secuencia potenciadora tal como la secuencia TMV-O.
Se conoce que la proteína de cubierta viral tiene una composición aminoacídica específica de grupo y es el único producto viral que tiene baja homología con otros grupos de virus. PVY-T es un virus vegetal que pertenece a Potyvirus. El silenciamiento génico de la presente invención se considera como atribuible a la reacción de protección de la planta contra la proteína de cubierta en el vector de silenciamiento génico de la presente invención y el potenciador del...
Reivindicaciones:
1. Uso de un vector de silenciamiento génico para silenciar un gen diana en una planta hospedadora, donde dicho vector de silenciamiento génico comprende:
un vector recombinante que incluye
un promotor,
una secuencia líder de ARN4 del virus del mosaico del pepino curso abajo del promotor,
un gen que codifica una proteína de cubierta de una cepa del virus Y de la necrosis de patata (PVY-N) que está curso abajo de la secuencia líder, y
un terminador que está curso abajo del gen,
donde, con el fin de causar silenciamiento génico del gen diana específico en una planta hospedadora, una construcción génica que comprende un promotor, una secuencia del gen diana y un terminador es insertada curso abajo del terminador del vector.
2. El uso según la reivindicación 1, donde dicho promotor es seleccionado del grupo que consiste en promotor 35S, promotor PAL y promotor PAL BOX.
3. El uso según la reivindicación 1, donde una pluralidad de las proteínas de cubierta es incorporada para suprimir la expresión del gen diana más fuertemente.
4. El uso según la reivindicación 1, donde la expresión del gen diana es suprimida, y la supresión es mantenida de forma estable no sólo en la presente generación de transformantes sino también en la progenie auto-fertilizante.
5. El uso según la reivindicación 4, donde dicho transformante además es cruzado con otra planta para alcanzar una generación híbrida, y el silenciamiento génico del gen diana es mantenido en la generación híbrida.
6. El uso según la reivindicación 1, donde la planta hospedadora es tabaco.
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