Variantes hipoalergénicas del alérgeno principal del polen de betula verrucosa.

Una proteína que es una variante hipoalergénica del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa (Bet v 1) y que se caracteriza por:



a) mostrar una reactividad reducida contra IgE en comparación con Bet v 1 silvestre (SEQ ID NO:1);

b) tener una secuencia de aminoácidos que:

i) es al menos 87%, preferentemente al menos 94%, más preferentemente al menos 97% idéntica a SEQ ID NO:1;

ii) en una alineación de secuencia con SEQ ID NO:1, presenta una sustitución o eliminación del residuo de Lys correspondiente al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09175143.

Solicitante: LOFARMA S.P.A..

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIALE CASSALA, 40 20143 MILANO ITALIA.

Inventor/es: FALAGIANI, PAOLO, MISTRELLO, GIOVANNI, RONCAROLO, DANIELA, ZANOTTA, STEFANIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/36 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › del polen.
  • C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
  • C12N15/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).

PDF original: ES-2441217_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Variantes hipoalergénicas del alérgeno principal del polen de betula verrucosa.

La presente invención proporciona variantes de secuencia hipoalergénicas de la proteína Bet v 1, moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas, composiciones farmacéuticas que contienen las mismas y su uso en la profilaxis y la terapia de enfermedades alérgicas provocadas por el polen de las plantas de la especie Betula verrucosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las alergias son provocadas por una disfunción del sistema inmunitario, que reacciona contra las proteínas inocuas contenidas en el polen, los ácaros, epitelios y ciertos alimentos produciendo anticuerpos de la clase IgE.

Datos recientes indican que más del 10% de la población en los países occidentales padece esta enfermedad, cuyos síntomas pueden deteriorarse con el tiempo y dar lugar a, por ejemplo, asma o una sensibilización a otros alérgenos haciendo así más difícil la elección de la terapia adecuada.

La inmunoterapia hiposensibilizante específica, a diferencia de la terapia farmacológica, es el único tratamiento etiológico de enfermedades alérgicas que puede cambiar favorablemente los parámetros inmunológicos en los que se basan estas enfermedades.

La inmunoterapia hiposensibilizante consiste en la administración de dosis crecientes de extractos normalizados (vacunas) obtenidos a partir de la misma sustancia que provoca la enfermedad (1) . De este modo, una especie de tolerancia inmunológica a dicha sustancia se induce gradualmente en el paciente con la posterior desaparición de los síntomas alérgicos.

Sin embargo, el riesgo de provocar efectos secundarios graves (2) , aunque marcadamente reducidos con el uso de vacunas de liberación lenta o vacunas administradas a través de vías alternativas a las inyecciones, ha limitado de hecho la aplicación de la inmunoterapia hiposensibilizante específica en el tratamiento de enfermedades alérgicas.

En los últimos años, la mayor parte de la atención se ha centrado en el desarrollo de vacunas eficaces, más seguras. En particular, el desarrollo de vacunas que consisten en proteínas recombinantes mutagenizadas, es decir, variantes hipoalergénicas capaces de influir favorablemente en el progreso natural de la enfermedad sin provocar efectos secundarios no deseados (3) , ha representado un objetivo importante.

El polen de plantas conocidas taxonómicamente como Fagales (abedul, aliso, avellano, roble, carpe) es una de las causas más importantes de rinitis alérgica y asma en las regiones templadas. Los dos alérgenos principales del polen del abedul, Bet v 1 (ADNc depositado en GenBank con el núm. de acceso X15877) y Bet v 2 (núm. de acceso M65179) son proteínas con un peso molecular de 17 y 14 kD, respectivamente (4, 5) . Cerca del 95% de los pacientes con alergia al polen del abedul producen anticuerpos IgE contra Bet v 1 y el 60% de estos pacientes muestran reactividad contra Bet v 1 solo (6) . Bet v 1 está presente de manera natural en más de diez isoformas que muestran una identidad de secuencia comprendida entre 84, 4% y 99, 4% (7) . Este alérgeno pertenece a la familia de las “proteínas relacionadas con la patogénesis”, es decir, proteínas ubicuas producidas por plantas en respuesta al estrés patológico o ambiental, donde se supone que sus funciones están relacionadas con el transporte de esteroides (8, 9) . La alta homología de secuencia con los alérgenos del grupo 1 en el polen de otras plantas del orden Fagales explica por qué los pacientes con IgE específicas para Bet v 1 muestran síntomas alérgicos durante la temporada de polinización de diferentes plantas que pertenecen al mismo orden taxonómico (10) . La alergia al polen del abedul se acompaña frecuentemente de reacciones adversas provocadas por la ingesta de frutas (por ejemplo, cereza, manzana, pera) o vegetales (por ejemplo, apio y zanahoria) frescas. La razón es que tales alimentos contienen proteínas caracterizadas por una alta homología de estructura y secuencia con Bet v 1, que son reconocidas por IgE específicas producidas por el alérgeno principal del abedul (11) . La inmunoterapia con el alérgeno Bet v 1 puede ser eficaz en el tratamiento de la alergia al polen del abedul así como la polinosis a otras plantas del orden Fagales y la alergia a alimentos que contienen alérgenos que reaccionan de manera cruzada con Bet v 1 (12) .

Un factor que se correlaciona con los efectos beneficiosos de la inmunoterapia hiposensibilizante es la inducción de anticuerpos IgG específicos para el alérgeno sensibilizante. Tales anticuerpos (protectores) pueden inhibir la unión de IgE al antígeno, específicamente a Bet v 1, alterando la conformación tridimensional de esta molécula (13, 14) . El desarrollo de vacunas que consisten en proteínas recombinantes que poseen menos alergenicidad y propiedades inmunogénicas inalteradas podría mejorar la terapia de enfermedades alérgicas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado ahora que sustituyendo o eliminando uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia de proteína del alérgeno Bet v 1, éste se hace menos reactivo contra a los anticuerpos IgE.

En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína hipoalergénica que es una variante de secuencia del alérgeno Bet v 1, caracterizada por:

mostrar una actividad reducida contra IgE en comparación con el alérgeno Bet v 1 silvestre (SEQ ID NO:1) ;

2) tener una secuencia de aminoácidos que:

es al menos 87%, preferentemente al menos 94%, más preferentemente al menos 97% idéntica a SEQ ID NO:1;

en una alineación de secuencia con SEQ ID NO: 1, presenta una sustitución o eliminación del residuo de Lys correspondiente a al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1.

Se prefieren variantes de sustitución en vez de eliminación, especialmente aquellas en las que el residuo de Lys en las posiciones indicadas se sustituye por un aminoácido neutro o polar. Más preferentemente, dicho aminoácido neutro o polar se selecciona de Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, aún más preferentemente de Ala, Thr y Ser.

En una realización preferida, la proteína hipoalergénica consiste en SEQ ID NO:2. Las variantes de sustitución y/o eliminación del alérgeno Bet v 1 de acuerdo con esta invención, en comparación con su contraparte silvestre, muestran una reducción de la reactividad de IgE de al menos 25%, preferentemente al menos 50%, más preferentemente al menos 80%, contra el suero de pacientes alérgicos al polen de Betula verrucosa.

La reactividad de IgE de la proteína SEQ ID NO:2 de un conjunto de sueros de pacientes alérgicos se sometió a prueba en un ensayo ELISA (figura 1) . En comparación con el alérgeno Bet v 1 silvestre (SEQ ID NO:1) , se observó una reducción media de 56% de la reactividad de IgE con SEQ ID NO: 2, cuando se incubó esta proteína con varias diluciones (de 1:2 a 1:8) de conjuntos de suero de pacientes alérgicos al polen del abedul.

Estos resultados se confirmaron por experimentos de inhibición ELISA, que permiten evaluar la reactividad de epítopos homólogos de diferentes proteínas. Estos resultados indican claramente que las sustituciones del aminoácido en la posición 54 de SEQ ID NO:1 disminuye el reconocimiento del alérgeno Bet v 1 por IgE.

Además, la reactividad de las proteínas de SEQ ID NO:2 contra IgE de un conjunto de suero positivo para polen de Betula verrucosa se sometió a ensayo por inmunotransferencia de tipo Western. También en este caso, se observó una reducción de la reactividad de IgE en el suero analizado, que, en comparación con Bet v 1 (SEQ ID NO:1) , era de 88% para SEQ ID NO:2.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un péptido inmunológicamente activo correspondiente a un fragmento de Bet v 1 que contiene de 15 a 35, más preferentemente de 15 a 20 residuos de aminoácido y que porta las sustituciones y/o eliminaciones descritas anteriormente. Como se usa en la presente descripción, la expresión “péptido inmunológicamente activo” indica un péptido que es capaz de provocar una respuesta inmune dependiente de IgE.

De acuerdo con la invención pueden prepararse fácilmente variantes de sustitución y/o eliminación mediante mutagénesis de la secuencia de ADNc de Bet v 1 (SEQ ID NO:6) usando métodos y técnicas conocidos por cualquier experto en la técnica.

Las secuencias de ADNc que codifican para las variantes de sustitución única SEQ ID NO:2 se identifica en SEQ ID NO:7.

En otros aspectos, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína Bet v 1 hipoalergénica descrita en la presente descripción, o un péptido derivado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína que es una variante hipoalergénica del alérgeno principal del polen de Betula verrucosa (Bet v 1) y que se caracteriza por: a) mostrar una reactividad reducida contra IgE en comparación con Bet v 1 silvestre (SEQ ID NO:1) ; b) tener una secuencia de aminoácidos que: i) es al menos 87%, preferentemente al menos 94%, más preferentemente al menos 97% idéntica a SEQ ID NO:1; ii) en una alineación de secuencia con SEQ ID NO:1, presenta una sustitución o eliminación del residuo de Lys correspondiente al aminoácido 54 de SEQ ID NO:1.

2. Una proteína según la reivindicación 1, en donde dicho residuo de Lys se sustituye por aminoácidos neutros o polares.

3. Una proteína según la reivindicación 2, en donde dichos aminoácidos neutros o polares se seleccionan de Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Ser.

4. Una proteína según la reivindicación 3, en donde dichos aminoácidos son Ala, Ser o Thr.

5. Una proteína según la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.

6. Un fragmento de péptido inmunológicamente activo de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 15, que contiene de 15 a 35 aminoácidos y que porta la sustitución y/o eliminación de Lys tal como se definió anteriormente.

7. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 6, que contiene de 15 a 20 aminoácidos.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 o para un péptido según las reivindicaciones 6-7.

9. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, que tiene la secuencia SEQ ID NO:7.

10. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8-9.

11. Una célula huésped que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, o un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 6-7, junto con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, que está en forma de una vacuna.

14. Uso de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, o un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 6-7, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades alérgicas.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, para el tratamiento de asma bronquial, rinitis, conjuntivitis y dermatitis atópica.


 

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