Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas.

Una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora,

presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de aminoácidos con al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos: **Fórmula**

presentando dicha variante únicamente una, dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución L417V, L417A, L417D, L417E, L417F, L417G, L4171, L417K, L417Q, L417R, L417S, L417T, L417W o L417Y en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a variantes de una glucoamilasa precursora que presentan propiedades modificadas (p. ej., termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas) . En concreto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden las glucoamilasas variantes, entre las que se incluyen composiciones hidrolizantes de almidón, composiciones de pienso animal y composiciones de limpieza. La invención también hace referencia a construcciones de ADN que codifican las variantes y a métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las enzimas de glucoamilasa (glucano 1, 4-α-glucohidrolasas, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas hidrolizantes de almidón que actúan en exo, que catalizan la eliminación de unidades de glucosa sucesivas de los extremos no reductores de moléculas relacionadas con oligosacáridos o polisacáridos o almidón. Las glucoamilasas pueden hidrolizar tanto los enlaces glucosídicos lineales como ramificados de almidón (p.ej.,

amilosa y amilopectina) .

Las glucoamilasas se producen mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Especialmente interesantes, y comercialmente importantes, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen de forma extracelular, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun. 48:529-544; Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 -1102; Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. 20 Chem. 53:923 -929; patente estadounidense 5.024.941; patente estadounidense 4.794.175 y WO 88/09795) ; Talaromyces (patente estadounidense 4.247.637; patente estadounidense 6.255.084 y patente estadounidense 6.620.924) ; Rhizopus (Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957 -964; Ashikari et al., (1989) App. Microbiol. and Biotech. 32:129 -133 y patente estadounidense 4.863.864) ; Humicola (WO 05/052148 y patente estadounidense 4.618.579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:210 -217) .

Muchos de los genes que codifican estas enzimas han sido clonados y expresados en células bacterianas, fúngicas y/o levadura.

Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p. ej., para la producción de glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón) . Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz con alto 30 contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse, y normalmente se utilizan, con alfa-amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar almidón en dextrinas y posteriormente glucosa. La glucosa puede entonces convertirse en fructosa por parte de otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa) ; cristalizada; o utilizada en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol y 1, 3-propanodiol) . El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de almidón y/o material que contiene celulosa puede utilizarse como una fuente de combustible o para consumo alcohólico.

WO 2006/060062 expone la glucoamilasa Trichoderma reesei TrGA y los usos en conversión de almidón, pienso animal y fermentación de alcohol.

Aunque las glucoamilasas se han utilizado con éxito en aplicaciones comerciales durante muchos años, todavía existe la necesidad de nuevas glucoamilasas con propiedades modificadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona variantes de glucoamilasa que son variantes de una glucoamilasa precursora, en la que las que la glucoamilasa precursora presenta una secuencia de aminoácidos con al menos 45 un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:

y las variantes presentan solo una, dos, tres o cuatro sustituciones comparadas con la glucoamilasa precursora, en las que las sustituciones comprenden la sustitución L417V, L417A, L417D, L417E, L417F, L417G, L417I, L417K, L417Q, L417R, L417S, L417T, L417W o L417Y en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en la glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa son variantes de una glucoamilasa precursora que presenta al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan únicamente dos, tres o cuatro sustituciones comparadas con la glucoamilasa precursora, en las que las sustituciones adicionales se eligen de 10 entre sustituciones correspondientes a la posición 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61, 67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263. 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 418, 430, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en la glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan actividad específica aumentada comparadas con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2. En algunas formas de realización, la variante de glucoamilasa de la reivindicación 1, en la que las variantes presentan termoestabilidad aumentada comparadas con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2. En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada comparadas con la glucoamilasa que comprende SEQ ID NO:2.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa son variantes de una glucoamilasa precursora obtenida a partir de una Trichoderma spp.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican variantes de glucoamilasa como 25 se define en la reivindicación 1.

También se proporcionan células huésped que comprenden polinucleótidos de la invención.

La presente invención también proporciona composiciones de enzima que comprenden variantes de glucoamilasa como se define en la reivindicación 1.

En algunas formas de realización, las composiciones de enzima son adecuadas para utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una composición de pienso animal o un proceso de fermentación de sustrato con almidón. En algunas formas de realización, las composiciones de enzima comprenden además un alfa amilasa.

La presente invención también proporciona métodos para producir glucoamilasas variantes en una célula huésped que comprenden: la transformación de células huésped con construcciones de ADN que comprenden polinucleótidos de la invención y el cultivo de células huésped en las condiciones adecuadas para la expresión y producción de variantes de glucoamilasa y la producción de variantes.

En algunas formas de realización, los métodos comprenden además la recuperación de las variantes de glucoamilasa del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La fig. 1A ilustra una glucoamilasa Trichoderma reesei (TrGA) que presenta 632 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) El péptido señal se subraya, la región catalítica (SEQ ID NO:3) que comienza con los residuos de aminoácidos SVDDFI (SEQ ID NO:12) y que presenta 453 residuos de aminoácidos está en negrita; la región de enlace está en cursiva y el dominio de unión a almidón (SBD) está tanto en cursiva como subrayado. La proteína madura que incluye el dominio catalítico (SEQ ID NO:3) , la región de enlace (SEQ ID NO:10) y el

dominio de unión a almidón (SEQ ID NO:11) se representan mediante SEQ ID NO:2. La fig. 1B ilustra el ADNc (SEQ ID NO:4) que codifica la TrGA. La fig. 1C ilustra los dominios de TrGA de proteína madura y precursora. La fig. 2 ilustra el plásmido de destino pDONR-TrGA que incluye el ADNc (SEQ ID NO:4) de la TrGA. La fig. 3 ilustra el plásmido pTTT-Dest.

La fig. 4 ilustra el vector de expresión final pTTT-TrGA. Las figs. 5A-5B ilustran una comparación de alineación de los dominios catalíticos de las glucoamilasas precursoras que incluyen glucoamilasa derivada de Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO:5) ; Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO:6) ; Aspergillus or y zae (AoGA) (SEQ... [Seguir leyendo]

1. Una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora, presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de aminoácidos con al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:

presentando dicha variante únicamente una, dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución L417V, L417A, L417D, L417E, L417F, L417G, L4171, L417K, L417Q, L417R, L417S, L417T, L417W o L417Y en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

2. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha glucoamilasa precursora presenta al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.

3. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha variante presenta únicamente dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, sustituciones adicionales que se eligen de sustituciones en una posición correspondiente a la posición 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61,

67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263. 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 418, 430, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

4. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

5. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

6. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende SEQ ID NO:2.

7. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa precursora se obtiene a partir de una Trichoderma spp.

8. Un polinucleótido que codifica la variante de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la composición es adecuada para

utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una composición de pienso animal o un proceso de 35 fermentación de sustrato que contiene almidón.

12. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además un alfa-amilasa.

13. Un método para producir una glucoamilasa variante en una célula huésped que comprende:

la transformación de una célula huésped con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 y el cultivo de la célula huésped con las condiciones adecuadas para la expresión y producción de dicha variante de glucoamilasa y la producción de dicha variante.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa de dicho cultivo.

Dibujos