Variantes de alfa-amilasa.

Alfa-amilasa

i) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 o 8 en la presente

, o

ii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 o figura 2, o

iii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3, o

iv) alfa-amilasa que muestra al menos el 90% de homología con las alfa-amilasas de i), ii) o iii),

donde la alfa-amilasa comprende una de las siguientes alteraciones: T49L, F, V, Y o I y donde la posición 49 corresponde a la posición 49 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 4.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07106717.

Solicitante: NOVOZYMES A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Krogshøjvej 36 2880 Bagsvaerd DINAMARCA.

Inventor/es: SVENDSEN, ALLAN, BISG RD-FRANTZEN, HENRIK, J RGENSEN, CHRISTEL, THEA, ANDERSEN, CARSTEN, KJÆRULFF,SØREN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES... > COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA... > Otros compuestos que entran en las composiciones... > C11D3/386 (Preparaciones que contienen enzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/28 (alfa-amilasa de origen microbiano, p. ej. amilasa bacteriana)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/06 (Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/14 (preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/15 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/07 (Bacillus)
  • C12S11/00

PDF original: ES-2496568_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Variantes de alfa-amilasa

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes nuevas de alfa-amilasas progenitoras tipo Termamyl, sobre todo a variantes que presentan propiedades alteradas, en particular un modelo de seccionamiento alterado (con respecto al progenitor) que es ventajoso con respecto a las aplicaciones de las variantes, en particular, en el tratamiento del almidón industrial (p. ej., licuefacción o sacarificación del almidón) . 10

Antecedentes de la invención

Las alfa-amilasas (alfa-1, 4-glucan4-hidrolasas, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados. 15

Hay un cuerpo muy extenso de patentes y bibliografía científica relacionadas con esta clase de enzimas industrialmente muy importantes. Varias alfa-amilasas tales como las variantes de las alfa-amilasas tipo Termamyl son conocidas a partir de, p. ej., WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96/23874 y WO 97/41213.

La reciente descripción relacionada con las alfa-amilasas comprende el documento WO 96/23874 el cual proporciona datos estructurales de cristales tridimensionales por rayos X para una alfa-amilasa tipo Termamyl, a la que se hace referencia como BA2, que consiste en 300 residuos de aminoácidos N-terminales de alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 6 en la presente y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la alfa-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de 25 aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente (estando disponible comercialmente con el nombre comercial TermamylTM) , y que está por tanto muy relacionada con las alfa-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en este contexto se incluyen dentro del significado de los términos "alfa-amilasas de tipo Termamyl", y que incluyen, entre otros, las alfa-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus) . El documento WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, basándose en un análisis de la estructura de una alfa-amilasa 30 progenitora tipo Termamyl, variantes de la alfa-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas relativas al progenitor.

WO 96/23874 y WO 97/41213 (Novo Nordisk) exponen variantes de la alfa-amilasa tipo Termamyl con un modelo de seccionamiento alterado que contiene mutaciones en los residuos de aminoácidos V54; D53; Y56; Q333; 35 G57 y A52 de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a alfa-amilasas tal y como se define en la reivindicación 1, que son ventajosas 40 con respecto al tratamiento industrial del almidón (licuefacción del almidón, sacarificación y similares) .

Los inventores han encontrado de forma sorprendente variantes con propiedades alteradas, en particular un modelo de seccionamiento alterado que tiene una capacidad reducida mejorada para seccionar un sustrato cerca del punto de ramificación, y que además tienen una especificidad de sustrato mejorada y/o una actividad específica 45 mejorada, en comparación con el WO 96/23874 y WO 97/41213 (Novo Nordisk) descrita como variantes de alfa-amilasa de tipo Termamyl con un modelo de seccionamiento alterado que contiene mutaciones en los residuos de aminoácidos V54;D53;Y56;Q333;G57 y A52 de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 en la presente.

La invención además se refiere a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a composición que 50 comprende alfa-amilasas de la invención, a vectores de expresión recombinantes que transportan los constructos de ADN, a las células transformadas con los constructos de ADN, y al uso de alfa-amilasas y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas alfa-amilolíticas, en varios procesos industriales, p. ej., en la licuefacción del almidón, y en composiciones de detergentes, tales como composiciones de limpieza para la ropa, para lavavajillas y para superficies duras; para la producción de etanol, como la producción de etanol para combustible, para 55 bebidas e industrial; para el desencolado de telas, tejidos o prendas etc.

Nomenclatura

En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos convencionales de una sola letra y de tres 60 letras para residuos de aminoácidos. Para mayor facilidad de referencia, las variantes de alfa-amilasa de la invención se describen usando la nomenclatura siguiente:

Aminoácido (s) original (es) :posición (es) :aminoácido (s) substituido (s)

Según esta nomenclatura, por ejemplo la sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 se indica como:

Ala30Asn o A30N

una deleción de alanina en la misma posición está mostrada como:

Ala30* o A30* 5

y la inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como la lisina, se indica como:

* 30aLys o *30aK

Una deleción de un segmento consecutivo de residuos de aminoácidos, tal como los residuos de aminoácidos 30-33, se indica como (30-33) * o  (A30-N33) o delta (A30-N33) . 10

Cuando una alfa-amilasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras alfa-amilasas y se hace una inserción en esa posición esto se indica como:

* 36aAsp o *36aD

para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36 15

Las mutaciones múltiples están separadas por signos de suma, por ejemplo:

Ala30Asp + Glu34Ser o A30N+E34S

representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo la alanina y el ácido glutámico por asparraguina y serina, respectivamente. Las mutaciones múltiples pueden también ser separadas como sigue, es decir, significando lo mismo que la suma: 20

Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S

Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición esto se indica como A30N, E o 25

A30N o A30E

Además, cuando una posición adecuada para la modificación está identificada en la presente sin que se haya sugerido una modificación específica, o A30X, se entenderá que cualquier residuo de aminoácido puede ser sustituido por el residuo de aminoácido presente en la posición. Así, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una 30 alanina en la posición 30, pero no se especifica, o se especifica como "X", se entenderá que la alanina puede ser delecionada o sustituida por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquier: R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

Descripción detallada de la invención [0015]

Figura 1 muestra SEC ID NO:1 de WO95/26397.

Figura 2 muestra SEC ID NO:2 de WO95/26397.

Figura 3 muestra la secuencia de Bacillus sp. #707 alfa-amilasa de Tsukamoto et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, FSI (1988) , págs. 25-31. 40

Alfa-amilasa tipo Termamyl

Es bien sabido que varias alfa-amilasas producidas por Bacillus spp. son muy homólogas a nivel aminoácido. Por ejemplo, se ha encontrado que la alfa-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos 45 mostrada en la SEC ID NO: 4 (comercialmente disponible como TermamylTM) tiene un 89% de homología con la alfa-amilasa de B.amiloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 6 y aproximadamente un 79% de homología con la alfa-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 8. Además las alfa-amilasas homólogas incluyen una alfa-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289;... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Alfa-amilasa i) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4 o 8 en la presente, o ii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 o figura 2, o 5

iii) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3, o iv) alfa-amilasa que muestra al menos el 90% de homología con las alfa-amilasas de i) , ii) o iii) ,

donde la alfa-amilasa comprende una de las siguientes alteraciones: T49L, F, V, Y o I y donde la posición 49 corresponde a la posición 49 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 4.

2. Alfa-amilasa según la reivindicación 1, que comprende una mutación en una posición correspondiente a una de las siguientes mutaciones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4:

A52S+V54N+T49L , y T49L+A52V+G107A+A111V.

3. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa según la 15 reivindicación 1 o 2.

4. Vector de expresión recombinante que transporta un constructo de ADN según la reivindicación 3.

5. Célula transformada con un constructo de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4. 20

6. Célula según la reivindicación 5, que es un microorganismo, en particular una bacteria o un hongo, tal como una bacteria Gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis. 25

7. Composición que comprende:

(i) una mezcla de la alfa-amilasa de B. licheniformis teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4 con una o más alfa-amilasas según la reivindicación 1 o 2 derivada de la alfa-amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8; o 30

(ii) una mezcla de la alfa-amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 con una o más alfa-amilasas según la reivindicación 1 o reivindicación 2 derivada de una o más otras alfa-amilasas; o (iii) una mezcla de una o más alfa-amilasas según la reivindicación 1 o 2 derivada de la alfa amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 con una o más alfa-amilasas según la 35 reivindicación 1 o 2 derivada de una o más otras alfa-amilasas progenitoras.

8. Composición según la reivindicación 7 que comprende:

una mezcla de una o más alfa-amilasas de la reivindicación 1 o 2 derivada de la alfa amilasa de B. stearothermophilus teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 8 y alfa-amilasa derivada de la alfa-40 amilasa de B. licheniformis teniendo la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 4.

9. Uso de una alfa-amilasa según la reivindicación 1 o 2 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 o 8 para la licuefacción del almidón; en una composición de detergente, tal como composiciones para el lavado de la ropa, para lavavajillas y para la limpieza de superficies duras; para la 45 producción de etanol, como la producción de etanol para combustible, para bebidas e industrial; para el desencolado de telas, tejidos o prendas.