Vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonia porcina.

Un método para obtener una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae inmunógena y no hemolítica,

a partir de una cepa virulenta de App, caracterizado porque comprende la etapa de modificar al menos un segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIA y eventualmente un segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIIA,

en el que el segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIA corresponde a los nucleótidos 697 a 759, o nucleótidos 886 a 945, o nucleótidos 1105 a 1215,

en el que el segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIIA corresponde a los nucleótidos 697 a 759, o nucleótidos 886 a 945, o nucleótidos 1105 a 1215,

en el que el segmento del dominio transmembrana del gen se modifica por sustitución o por inserción de uno o varios nucleótidos, o por deleción parcial o total de un segmento del gen, o bien mediante la disrupción por mutagénesis inducida químicamente o inducida por radiación, y

en el que la modificación no excede de los dominios transmembrana de los genes apxIA y apxIIA.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2003/012839.

Solicitante: LABORATORIOS HIPRA, S.A..

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: BRU VIRGILI,SERGI, QUEROL MURILLO,ENRIQUE, ESPUÑA MASO, ENRIC, PINOL RIBAS,Jaume.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/102 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Pasteurella; Haemophilus.
  • C07K14/285 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Pasteurellaceae (F), p. ej. Haemophilus influenza.
  • C12N1/36 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Adaptación o atenuación de células.

PDF original: ES-2381973_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonía porcina.

Campo de la técnica La presente invención se refiere a un método para obtener una cepa modificada de Actinobacillus pleuropneumoniae, inmunógena y no hemolítica, útil para preparar una vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonía porcina.

Estado de la técnica anterior

Actinobacillus pleuropneumoniae (en adelante, "App") es una bacteria Gram-negativa causante de la pleuroneumonía porcina, enfermedad infecciosa respiratoria, de distribución mundial, responsable de grandes pérdidas económicas en la industria porcina.

Los factores de virulencia más importantes de App son proteínas extracelulares: las exotoxinas Apx. Estas exotoxinas pertenecen a la familia de toxinas formadoras de poros denominadas RTX, ampliamente distribuidas entre las bacterias patógenas Gram-negativas. Las principales exotoxinas en App son las siguientes: ApxI, ApxII, ApxIII, y ApxIV.

Las exotoxinas ApxI y ApxII son hemolíticas y citolíticas. La ApxI tiene una actividad hemolítica y citolítica fuerte y la ApxII una actividad hemolítica débil y una actividad citolítica moderada.

Si bien todos los serotipos analizados son capaces de producir ApxIV, existe una distribución característica de serotipo para la expresión del resto de exotoxinas Apx. Los serotipos 1, 5, 9 y 11 producen las exotoxinas ApxI y ApxII; el serotipo 10 produce tan sólo la ApxI; los serotipos 7 y 12 producen solamente la ApxII y los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 producen la ApxII y la ApxIII.

Los genes correspondientes a las exotoxinas ApxI y ApxII están organizados en forma de operón. El operón de la exotoxina ApxI dispone de cuatro genes: apxIC, apxIA, apxIB y apxID. El gen apxIA codifica para la exotoxina ApxI propiamente dicha. El gen apxIC codifica una proteína activadora (acilasa) que se encarga de introducir una modificación post-traduccional en la ApxI (acilación) que permite que la ApxI adquiera la conformación activa, capacitándola para la interacción con los receptores celulares específicos del huésped. Los genes apxIB y apxID codifican dos proteínas de membrana que se encargan de secretar la exotoxina ApxI madura al medio externo.

El operón de la ApxII dispone sólo del gen A (apxIIA) y del gen C (apxIIC) , que codifican respectivamente para la ApxII y para la acilasa encargada de que la ApxII adquiera su conformación activa. Existe también un pequeño fragmento que muestra similitud con el gen apxIB, pero que no da lugar a ninguna proteína funcional. La exportación de la ApxII madura al medio externo se realiza gracias a las proteínas codificadas por los genes apxIB y apxID.

Los métodos actuales de vacunación no proporcionan una protección completa frente a todos los serotipos de App.

En la solicitud de patente WO97/16532A1 se describe la obtención de una cepa vacunal de App capaz de inducir una respuesta inmunológica en un animal que comprende un organismo modificado que produce una toxina Apx inactivada parcial o totalmente debido a la deleción parcial, por mutagénesis inducida, de un gen estructural apxIA y/o a la deleción parcial de un gen activador apxIIC. No modifica la zona transmembrana.

En la solicitud de patente EP810283A2 se describe la obtención de una cepa vacunal de App modificada en el gen apxIC de manera que no produce la proteína activadora en forma funcional y ésta no puede activar la toxina por acilación. Tampoco modifica la zona transmembrana.

Jansen et al (Infection and Immunity 63:27-37 (1995) ) describe la producción de recombinantes homólogos de App mediante mutagénesis dirigida. Los mutantes tienen el gen apxIA inactivado por inserción del gen CMr y/o el gen apxIIA inactivado por inserción del gen TETr.

Tascón et al (Molecular Microbiology 14:207-216 (1994) describe dos mutantes de App. Uno de ellos tiene una disrupción en el gen apxIBD y el otro una disrupción en el gen estructural apxIA.

Reimer et al (Microbial Patogenesis 18:197-209 (1995) ) describe un mutante avirulento de App que, por mutación química, tiene deleciones que afectan partes importantes del operón apxIABCD. Este mutante no sintetiza la toxina ApxI, pero sí la ApxII, aunque no la secreta de la célula.

Las cepas que no expresan las exotoxinas ApxI y ApxII, no pueden ser utilizadas como vacuna atenuada porque dan lugar a respuestas inmunes no protectoras, debido a que las exotoxinas ApxI y ApxII son uno de los factores más importantes determinantes de la virulencia de App.

Prideaux (The 16th International Pig Veterinar y Society Congress, Melbourne, Australia, 17-20 Sept. 2000, p. 439442) describe una vacuna preparada a partir de una cepa que tiene inactivado el gen apxIIC y que expresa y secreta una toxina ApxII no activada, incapaz, por tanto, de unirse a las células diana.

Así, las vacunas vivas atenuadas descritas en el estado de la técnica anterior basadas en cepas de App sin capacidad hemolítica, son menos inmunoprotectivas porque han sufrido modificaciones en su estructura que no les permiten unirse al receptor de membrana de las células diana o porque no pueden generar anticuerpos frente a las toxinas ApxI y/o ApxII, al no ser secretadas por la célula.

Frey et al (Gene 142:97-102 (1994) ) describe la secuencia de aminoácidos de la exotoxina ApxI procedente de una cepa de serotipo 1, y Smits et al; Infect.Immun. 59:4497-4504 (1991) describe la secuencia de aminoácidos de la exotoxina ApxII de una cepa de serotipo 9.

Resumen de la invención

Los autores de la presente invención han descubierto un método para obtener una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae inmunógena y no hemolítica, a partir de una cepa virulenta de App, modificada al menos en un segmento del gen apxIA y eventualmente en un segmento del gen apxIIA, que codifican un dominio transmembrana de las exotoxinas Apx hemolíticas y citolíticas.

Esta cepa no tiene actividad hemolítica, pero mantiene la capacidad inmunoprotectora inalterada, y es útil para preparar una vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonía porcina.

Los dominios transmembrana de las exotoxinas ApxI y ApxII juegan un papel importante en la formación del poro en la membrana de la célula diana. Una vez formado este poro, se producen desequilibrios osmóticos que acaban finalmente produciendo la lisis de la célula diana.

Sorprendentemente se ha encontrado que la vacuna viva atenuada preparada con esta cepa modificada de App puede ser aplicada a bajas dosis, que contiene las toxinas ApxI y ApxII de App sin capacidad hemolítica y que contiene todos los antígenos inmunológicamente necesarios para obtener una respuesta inmunógena elevada.

El objeto de la presente invención es un método para obtener una cepa de App inmunógena y no hemolítica, a partir de una cepa virulenta de App, modificada al menos en un segmento del gen apxIA y eventualmente en un segmento del gen apxIIA, que codifican un dominio transmembrana de las exotoxinas Apx hemolíticas y citolíticas.

En un segundo aspecto la invención tiene también por objeto las cepas obtenibles mediante el método objeto de la invención y a las vacunas preparadas con las mismas.

En un tercer aspecto la invención tiene también por objeto las cepas de App depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo con los números de registro CECT 5985 y CECT 5994.

Descripción de las figuras Figura 1

En la figura 1 muestra una alineación realizada mediante el programa ClustalX (Thompson et al; Nucleic Acids Research 24:4876-4882 (1997) ) entre las secuencias de aminoácidos de la ApxI procedente de una cepa de serotipo 1 (Frey et al; Gene 142:97-102 (1994) ) y la ApxII de una cepa de serotipo 9 (Smits et al; Infect.Immun. 59:4497-4504 (1991) ) . En la figura se ha incluido sólo la secuencia situada entre los aminoácidos 1 a 594 de la ApxI y 1 a 590 de la ApxII. Sobre la alineación se encuentran enmarcadas las regiones H1 (aminoácidos 233 a 253) , H2 (aminoácidos 296 a 315) y H3 (aminoácidos 369 a 405) . Estas regiones corresponden respectivamente a los tres dominios transmembrana presentes en ambas Apx.

Figura 2

La figura 2 muestra un esquema con los pasos seguidos hasta la obtención del plásmidos híbridos pApxILH2 y pApxIILH2. En primer lugar, el plásmido pGP1 se obtuvo mediante digestión del plásmido pGP704 (Miller y Mekalanos; J.Bact. 170:2575-2583 (1988) ) con los enzimas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para obtener una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae inmunógena y no hemolítica, a partir de una cepa virulenta de App, caracterizado porque comprende la etapa de modificar al menos un segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIA y eventualmente un segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIIA, en el que el segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIA corresponde a los nucleótidos 697 a 759, o nucleótidos 886 a 945, o nucleótidos 1105 a 1215,

en el que el segmento que codifica un dominio transmembrana del gen apxIIA corresponde a los nucleótidos 697 a 759, o nucleótidos 886 a 945, o nucleótidos 1105 a 1215,

en el que el segmento del dominio transmembrana del gen se modifica por sustitución o por inserción de uno o varios nucleótidos, o por deleción parcial o total de un segmento del gen, o bien mediante la disrupción por mutagénesis inducida químicamente o inducida por radiación, y en el que la modificación no excede de los dominios transmembrana de los genes apxIA y apxIIA.

2. Un método según la reivindicación 1 caracterizado porque introduce una deleción en al menos un segmento del gen apxIA y eventualmente en un segmento del gen apxIIA, que codifican un dominio transmembrana de las exotoxinas Apx hemolíticas y citolíticas tal y como se define en la reivindicación 1.

3. Un método según la reivindicación 2 caracterizado porque introduce una deleción en el segmento del gen apxIA, que codifica el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxI de App correspondiente a los nucleótidos 886 a 945.

4. Un método según la reivindicación 3 caracterizado porque introduce una deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIA, que codifican el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxI de App.

5. Un método según la reivindicación 3 ó 4 caracterizado porque introduce además una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App correspondiente a los nucleótidos 886 a 945.

6. Un método según la reivindicación 5 caracterizado porque introduce una deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA, que codifican el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App.

7. Una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. La cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae inmunógena y no hemolítica depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 5985.

10. Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende la cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae según la reivindicación 9.

11. La cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae inmunógena y no hemolítica depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 5994.

12. Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende la cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae según la reivindicación 11.

Fragmento 1, 2 kb PstI con Kmr depUC4K PstI 3, 65

HindIII 0, 07 PstI 3, 07

BamHI 0, 49 SmaI 3, 5 Cla I3, 32 Xho I3, 23

PstI PstI3, 07

BamHI 2, 23

BamHI0, 49

- Fragmento 0, 9 kbEcoRV/EcoRI ApxIa -Fragmento1, 1 kb EcoRI/BglII ApxIa

EcoRV+BglII

EcoRI 0, 01

Ec oRI 0, 01 PstI 7, 65 KpnI 0, 28 HindI 7, 09 NdeI 0, 38 SmaI 6, 84 XhoI 0, 8 ClaI 6, 66 BamHI 0, 9 PstI 6, 59 XhoI 6, 57 SacI 1, 08 EcoRI 1, 52

PstI 6, 41 KpnI 1, 11 EcoRV 1, 53

Ec oRI 1, 52 KpnI 1, 78

EcoRV 1, 53

BamHI 5, 75 PstI 2, 26 BamHI 5, 57

BglII 2, 27 XhoI 2, 42

EcoRI 2, 4

SacI 2, 62 XbaI 2, 67

HindI 2, 95 Hinc II 3, 16 BglII 3, 35

HindIII 3, 59

HindI 3, 41 BamHI 3, 83

Figura 2

XhoI 0, 59 XhoI

apxIC H1 H3 apxIB apxID apxIA B A

B A

Figura 4

1 0. 0. 0. A600 0. 1 0. 0. 0. A405 1 0. 0. 0. 0. 0. 0.0 0 Tiempo (horas) Figura 5

A B

C M 1 2 3 123 12 3

Figura 6


 

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