VACUNA PARA LA PROTECCION DE ANIMALES FRENTE A LEISHMANIA.

La presente invención se relaciona, en general, con la prevención de la leishmaniasis en animales,

en particular, de la infección causada por Leishmania sp., que comprende la proteína P36 de Leishmania infantum, o un fragmento inmunogénico de la misma, o bien un sistema de expresión de dicha proteína o fragmento, opcionalmente junto con un compuesto que estimula la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1; asícomo varios protocolos de vacunación frente a Leishmania sp a partir del empleo de dicha vacuna

Vacuna para la protección de animales frente a Leishmania.

Sector de la técnica

La invención se relaciona, en general, con la prevención de la leishmaniasis en animales, en particular, con una vacuna para proteger animales de la infección causada por Leishmania sp.,basado en un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y una secuencia de ADN que codifica interleucina-12 (IL-12) o, alternativamente, un sistema de expresión seleccionado entre un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, en donde dicha vacuna se administra mediante protocolos de inmunización específicos que comprenden una inmunización inicial y una dosis de refuerzo en el que dicho sistema de expresión está involucrado.

Antecedentes de la invención

La leishmaniasis es un grupo de enfermedades parasitarias causadas por varias especies del género Leishmania. Dependiendo de la respuesta inmune del hospedador, la cepa infecciosa y la virulencia del parásito, las manifestaciones clínicas varían desde lesiones cutáneas que se curan de forma espontánea hasta la forma visceral, y fatal si no se trata, de la enfermedad. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que unos 12 millones de personas de todo el mundo están infectadas y 350 millones de personas tienen riesgo de infección (1). En los países mediterráneos la infección es zoonótica y el perro doméstico es el reservorio principal. La cepa endémica de Leishmania en la zona mediterránea es Leishmania infantum, que infecta tanto a seres humanos como a perros, produciendo leishmaniasis cutánea y visceral (2). Algunos estudios epidemiológicos han indicado que en España podrían estar infectados aproximadamente un 7% de los perros, mientras que otros autores han demostrado que el 10-37% de los perros del sur de Francia desarrollaban la leishmaniasis visceral (3). La OMS ha estimado que entre un 2% y un 9% de todos los pacientes con SIDA del sur de Europa desarrollarán leishmaniasis visceral, ya que L. infantum es el causante de la tercera enfermedad parasitaria más frecuente en individuos HIV-positivos en el área mencionada (4).

Un procedimiento adecuado para combatir la leishmaniasis endémica en los países mediterráneos y en otras partes del mundo sería la creación de una vacuna capaz de conferir inmunidad a largo plazo contra el parásito. La viabilidad de una vacuna contra este parásito complejo viene sugerida por el hecho de que los pacientes recuperados de la infección natural desarrollaron una fuerte inmunidad contra Leishmania (5, 6).

Como es bien conocido, en ratones, perros y en seres humanos, los clones de las células T helper (adyuvantes) CD4⁺ pueden dividirse en dos subseries funcionales, Th1 y Th2, de acuerdo con el perfil de las linfocinas producidas. La subserie Th1 produce preferentemente interferón gamma (IFN-?), mientras que la subserie Th2 produce predominantemente la interleucina (IL) 4 [IL-4] (7-9).

En un modelo murino infectado con Leishmania major (especie que produce leishmaniasis cutánea) se ha encontrado una clara correlación entre la resistencia a la infección y la creación de una respuesta Th1 CD4⁺ y, por otra parte, la susceptibilidad y el desarrollo de respuestas Th2 CD4⁺ (10, 11). Asimismo, en humanos y en perros, la resistencia a la leishmaniasis visceral también está asociada con una respuesta Th1 (12-15).

Recientemente se ha demostrado que la interleucina-12 (IL-12) es indispensable para proporcionar una inmunidad protectora contra L. major, ya que inicia respuestas inmunes Th1 protectoras y regula la proliferación de esta subpoblación de células T (16). De hecho, está bien establecido que IL-12 juega un papel crítico en la generación de células Th1 y en la diferenciación óptima de linfocitos T citotóxicos (CTL) (17). Por otra parte, la IL-12 también se ha usado como un adyuvante protector en otros modelos tales como Schistosoma (25), Listeria (26) o Bordetella (27).

En ensayos de vacunación experimentales contra la leishmaniasis murina, se han usado varios antígenos consiguiendo diferentes niveles de protección. Entre éstos se encuentran: gp63 de L. major (18), gp46 (19), LeIF (20, 21), LACK (22) y bibliotecas genómicas de expresión de L. major (23). Asimismo, el antígeno gp46 de L. amazonensis expresado por un virus vaccinia recombinante proporciona resultados alentadores con un alto grado de protección y memoria inmunológica a largo plazo (24).

LACK es una proteína de 36 kDa de L. major, denominada así por su homología con la proteína RACK (receptor de proteína quinasa C activada en mamíferos). Se ha demostrado que un fragmento de 24 kDa de dicha proteína protege contra la exposición a L. major en ratones cuando se administra por vía subcutánea como una proteína soluble en combinación con la citocina IL-12 co-estimuladora. Además, los ratones que recibieron dicho antígeno junto con IL-12 mostraron una regulación negativa del número de células productoras de IL-4 en los ganglios linfáticos drenantes 6 semanas después de la infección con L. major y una regulación positiva de los transcritos de IFN-? en comparación con los ratones no tratados (22). Los ratones se hicieron tolerantes a LACK (ratones transgénicos que expresaban el antígeno en el timo). Otros estudios han puesto de manifiesto que la eficacia protectora de LACK soluble de L. major junto con IL-12 era similar a la eficacia obtenida mediante la inmunización con 100 µg de ADN que expresaba el mismo antígeno (28).

Recientemente, se ha clonado y caracterizado la proteína P36 de L. infantum (29). El análisis de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína ha puesto de manifiesto que P36 está muy conservada (96-99%) entre las cepas estudiadas de Leishmania, L. major y L. chagasi (22, 30).

La capacidad protectora de P36 de L. infantum se ha ensayado previamente en ratones Balb/c inmunizados con dicha proteína soluble o con un sistema de expresión que expresa dicha proteína en unos ensayos de descarga que comprenden la administración a dichos animales de una dosis de inicio y otra de refuerzo del antígeno, seguido de exposición a promastigotes de L. major, y se ha determinado mediante la evaluación de las lesiones en la almohadilla de la pata donde se inoculó el parásito, la carga parasitaria presente en los ganglios linfáticos, y los parámetros inmunológicos antes y después de la exposición al parásito [Patente ES200100402, solicitada el 21 de Febrero de 2001 con el título "Vacuna para la protección de animales frente a Leishmania"].

No obstante, hasta ahora, no se ha publicado ni se conoce ningún resultado positivo sobre la protección del animal huésped por excelencia de la enfermedad, el perro, reservorio en Europa y América del Sur, ni se conoce si el tipo de respuesta celular frente a la enfermedad es similar a la mostrada en el modelo murino mediante la infección directa por L. infantum en los perros (Patente española ES200102057, solicitada el 12 de septiembre de 2001 titulada "Adición de la patente ES200100402 Vacuna para la protección de perros frente a Leishmania") que asimismo se incluye como parte de esta solicitud de patente PCT.

Descripción de la invención

La presente adición se enfrenta con el problema de proporcionar vacunas y protocolos de inmunización capaces de proteger a animales, perros entre otros,y humanos de la infección causada por Leishmania infantum, agente causal de la enfermedad canina y de la leishmaniosis visceral en Europa.

La solución proporcionada por esta invención se basa en el hecho de que los inventores han observado que la expresión conjunta o no en un animal de los genes que codifican un antigen asociado a Leishmania, e.g., el antigen P36 de L. infantum, y una molécula que estimula la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, por ejemplo, la IL-12 murina, contenida en un rVV o en un plásmido pRSET-B capaz de infectar animales, induce una respuesta inmune celular de tipo Th1 que está correlacionada con la protección contra leishmaniasis.

Los inventores también han observado que un protocolo de inmunización que comprende...

1. Una vacuna que comprende un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, en la que dicho compuesto co-estimulador es interleucina 12 (IL-12), para su uso en la protección de animales de una infección producida por Leishmania sp., en donde la vacuna es administrada mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial con una proteína P36 de L. infantum en forma soluble, seguida de inmunización con una dosis de refuerzo, en donde dicha dosis de refuerzo comprende dicho sistema de expresión.

2. Vacuna según la reivindicación 2, en donde dicho sistema de expresión es un plásmido o un virus Vaccinia.

3. Una vacuna que comprende un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, para su uso en la protección de animales de la infección producida por L. infantum, en la que la vacuna es administrada mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial y una dosis de refuerzo, en donde la inmunización inicial se lleva a cabo con dicho plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la dosis de inmunización de refuerzo se lleva a cabo con un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína L36 de L. infantum.