Una cepa aislada de astrovirus denominada CAstV-3, en que dicha cepa es la depositada bajo el número deAcceso CNCM I-3541 en el CNCM,

Instituto Pasteur, el 15 de diciembre de 2005.

Vacuna contra el virus del pollo y diagnóstico

Campo del invento

El presente invento se refiere a vacunas, kits de ensayo y métodos de detección para un nuevo astrovirus, en particular el astrovirus de tipo 3 del pollo (CAstV-3; del inglés, chicken astrovirus-3) . Las infecciones de pollos tomateros con este astrovirus de tipo 3 del pollo se asocian con enteritis y depresión del crecimiento y con posibles efectos negativos sobre el desarrollo del embrión de polluelo.

Antecedentes

Los problemas por depresión del crecimiento en pollos jóvenes, conocidos en la industria de la producción de aves de corral por diversas expresiones tales como "crecimiento retrasado", "enanismo-crecimiento retrasado" y síndrome de "crecimiento desigual", dan lugar a unos considerables costes económicos para las granjas afectadas. Dicha depresión del crecimiento se ha asociado con infecciones por una diversidad de virus que incluyen rotavirus y pequeños virus redondos, aún no caracterizados y conocidos como virus de tipo enterovirus (ELV; del inglés, enterovirus like viruses) . Puesto que los problemas clínicos causados por virus específicos están mal definidos a causa de la falta de ensayos diagnósticos específicos, es difícil estimar con precisión la exigencia de una vacuna para proteger de los problemas por depresión del crecimiento provocados por virus.

Las infecciones víricas de pollos se pueden transmitir horizontalmente por el virus que puede estar contaminando el alojamiento de los pollos; por ejemplo, con las infecciones entéricas, es probable que sea común una propagación fecal-oral. También se reconoce que puede tener lugar la transmisión vertical de infecciones entéricas a través del embrión de pollos parentales infectados con el virus.

Estudios previos [Veterinar y Laboratories Agency (VLA) , Weybridge] han mostrado que un virus de tipo enterovirus (ELV) , denominado FP3, podría ser detectado en el meconio (contenidos intestinales) de polluelos muertos en su cascarón, lo que sugeriría que este ELV estaba infectando el embrión y se transmitía verticalmente desde los padres infectados [Spackman et al. (1984) , Veterinar y Record 114: 216-218].

Los virus de tipo enterovirus incluyen picornavirus, astrovirus, calicivirus y similares, y pequeños virus esféricos sin envoltura que se replican en el citoplasma. Tienen un genoma de RNA y son estables en un pH de 3. Se ha sugerido que varios ELVs que son antigénicamente distintos entre sí causan depresión del crecimiento en aves.

Sumario del invento

Después de una amplia investigación virológica de aves enfermas de grupos del Reino Unido en 2004-5, los presentes inventores han aislado exitosamente de polluelos débiles un agente infeccioso. La caracterización de este agente sugiere que este agente vírico causa depresión del crecimiento en pollos jóvenes y posibles efectos negativos sobre embriones de polluelo.

De acuerdo con un primer aspecto del presente invento, se proporciona una nueva cepa aislada de astrovirus, denominada CAstV-3. Una muestra de esta cepa ha sido depositada bajo el número de Acceso CNCM I-3541 en el CNCM, Instituto Pasteur, el 15 de diciembre de 2005.

Los astrovirus son pequeños virus esféricos que tienen típicamente una morfología de estrella de 5 ó 6 puntas y un genoma de RNA de cadena sencilla y sentido positivo de aproximadamente 7 kb.

Se han caracterizado previamente diversos astrovirus en patos, pavos y gallinas; sin embargo, el astrovirus caracterizado por los presentes inventores es antigénicamente distinto, como se demuestra mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta.

Se ha secuenciado una región sustancial (~ 3, 3 kb) del genoma de CAstV-3. Esta región comprende parte del ORF 1b de astrovirus, la RNA polimerasa de astrovirus dependiente de RNA, una pequeña secuencia intergénica de 24 nucleótidos, y el ORF 2 de astrovirus, que codifica la región proteica de la cápsida, y la región 3' no traducida.

De acuerdo con un segundo aspecto, el presente invento proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que tiene una identidad secuencial de al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, aún más preferiblemente al menos 99%, y muy preferiblemente 100%, con respecto a

(a) una secuencia de nucleótidos como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. números 1 a 4,

(b) una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas con una porción de la ID. SEC. nº 4, que codifica un polipéptido antigénico capaz de generar una respuesta inmunogénica contra el astrovirus de tipo 3 del pollo, o

(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 4, en que dicho fragmento es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo (CAstV-3) , en que la identidad secuencial se refiere al porcentaje de restos de dos secuencias que son idénticos cuando se alinean éstas para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada, en que la ventana de comparación especificada es todos los restos de las secuencias.

Adecuadamente, una secuencia de nucleótidos del invento codifica una secuencia de aminoácidos que es capaz de generar una respuesta inmunogénica contra el astrovirus de tipo 3 del pollo. Adecuadamente, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de (a) o (b) codifica una secuencia de aminoácidos que es capaz de generar una respuesta inmunogénica contra el astrovirus de tipo 3 del pollo.

Adecuadamente, la respuesta inmunogénica es contra al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo (CAstV-3) .

El invento proporciona además una construcción génica que incluye al menos una secuencia de nucleótidos del segundo aspecto del invento y una secuencia de control, por ejemplo, un promotor.

Se proporciona además un vector que incluye una secuencia aislada de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto del invento y un promotor que está operativamente enlazado a dicha secuencia de nucleótidos. Los vectores adecuados incluyen virus (por ejemplo, vacciniavirus, adenovirus, baculovirus, etc.) , vectores de levadura, fagos, cromosomas, cromosomas artificiales, plásmidos y DNA de cósmido.

De acuerdo con un tercer aspecto del invento, se proporciona un método para producir un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos del invento, o un fragmento del mismo, que incluye las operaciones de:

(a) poner una célula bacteriana y/o una célula de insecto a través de un baculovirus y/o una célula de levadura y/o una célula vegetal en contacto con un vector como el aquí descrito, y

(b) cultivar dicha célula bacteriana y/o célula de insecto y/o célula de levadura y/o célula vegetal bajo unas condiciones adecuadas para la producción del polipéptido o el fragmento del mismo.

Adecuadamente, la célula bacteriana puede ser Escherichia coli.

Adecuadamente, el polipéptido es codificado por una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las ID. SEC. números 1 a 4.

Adecuadamente, el polipéptido es codificado por una secuencia de nucleótidos del astrovirus de tipo 3 del pollo.

El invento proporciona además un polipéptido producido sustancialmente mediante el método anterior. Como entenderán quienes tienen experiencia en la técnica, dicho polipéptido puede ser aislado o sustancialmente purificado a partir de la mezcla en que se expresa.

De acuerdo con un cuarto aspecto del presente invento, se proporciona una secuencia polipeptídica codificada por cualquier secuencia de nucleótidos del segundo aspecto del invento.

Preferiblemente, se proporciona una secuencia polipeptídica codificada por cualquiera de las ID. SEC. números 1 a

4.

Adecuadamente, un polipéptido del invento puede ser antigénico ya que presenta al menos un sitio antigénico hacia el cual se puede dirigir una respuesta inmune.

Polipéptidos antigénicos derivados de CAstV-3, por ejemplo, una proteína de la cápsida (ID. SEC. nº 5) o fragmentos de la misma, están... [Seguir leyendo]

1. Una cepa aislada de astrovirus denominada CAstV-3, en que dicha cepa es la depositada bajo el número de Acceso CNCM I-3541 en el CNCM, Instituto Pasteur, el 15 de diciembre de 2005.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a

(a) una secuencia de nucleótidos como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. números 1 a 4,

(b) una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas con una porción de la ID. SEC. nº 4, que codifica un polipéptido antigénico capaz de generar una respuesta inmunogénica contra el astrovirus de tipo 3 del pollo, o

(c) un fragmento de la ID. SEC. nº 4, en que dicho fragmento es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo (CAstV-3) ,

en que la identidad secuencial se refiere al porcentaje de restos de dos secuencias que son idénticos cuando se alinean éstas para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada, en que la ventana de comparación especificada es todos los restos de las secuencias.

3. Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos aislada como la reivindicada en la Reivindicación 2 y una secuencia de control.

4. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos aislada como la reivindicada en la Reivindicación 2 y un promotor que está operativamente enlazado a dicha secuencia de nucleótidos.

5. Un método para producir un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de la Reivindicación 2, que incluye las operaciones de:

(a) poner una célula bacteriana y/o una célula de insecto a través de un baculovirus y/o una célula de levadura y/o una célula vegetal en contacto con un vector como el reivindicado en la Reivindicación 4, y

(b) cultivar dicha célula bacteriana y/o célula de insecto y/o célula de levadura y/o célula vegetal bajo unas condiciones adecuadas para la producción del polipéptido.

6. Una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la ID. SEC. nº 5, en que la identidad secuencial se refiere al porcentaje de restos que son idénticos cuando se alinean para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada, en que la ventana de comparación es todos los aminoácidos de la ID. SEC. nº 5.

7. Una secuencia polipeptídica como la reivindicada en la Reivindicación 6, codificada por una secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 4.

8. Una secuencia polipeptídica como la reivindicada en la Reivindicación 6, que comprende la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 5 o un fragmento de la misma, en que dicho fragmento es una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo.

9. Un anticuerpo policlonal, en que dicho anticuerpo policlonal presenta especificidad ligante hacia un polipéptido de cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 8.

10. Un anticuerpo monoclonal, en que dicho anticuerpo monoclonal presenta especificidad ligante hacia un polipéptido de cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 8.

11. El uso de:

(i) al menos parte de una cepa de astrovirus aislada, denominada CAstV-3, como la definida en la Reivindicación 1,

(ii) una secuencia de nucleótidos como la reivindicada en la Reivindicación 2, o

(iii) un polipéptido como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 8,

en la preparación de una composición que es capaz de mediar en una respuesta inmune en un ave.

12. Una composición que comprende:

(i) al menos parte de una cepa de astrovirus aislada, denominada CAstV-3, como la definida en la Reivindicación 1,

(ii) al menos una secuencia de nucleótidos como la reivindicada en la Reivindicación 2, o

(iii) al menos un polipéptido como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 8.

13. Una vacuna para inmunización frente a la depresión del crecimiento en un ave, en que dicha vacuna comprende una composición como la reivindicada en la Reivindicación 12 y un agente adyuvante.

14. Un método de ensayo diagnóstico para la detección del astrovirus de tipo 3 del pollo en muestras de aves, que comprende las operaciones de:

(i) poner un material fisiológico aviar en contacto con una sonda, en que dicha sonda es seleccionada de entre:

(a) una secuencia de nucleótidos como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. números 1 a 4,

(b) una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas con una porción de la ID. SEC. nº 4 que codifica un polipéptido antigénico capaz de generar una respuesta inmunogénica contra el astrovirus de tipo 3 del pollo,

(c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a una secuencia de nucleótidos como la expuesta mediante la ID. SEC. nº 4, en que dicha secuencia de nucleótidos es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo, en que la identidad secuencial se refiere al porcentaje de restos de dos secuencias que son idénticos cuando se alinean éstas para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada, en que la ventana de comparación especificada es todos los restos de las secuencias,

(d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 4, en que dicho fragmento es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo,

(e) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos como la expuesta mediante la ID. SEC. nº 4 o un fragmento de la misma, en que dicho fragmento es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo, y

(f) un anticuerpo con especificidad ligante hacia un polipéptido de (e) , y

(ii) detectar un proceso de unión exitoso entre la sonda y al menos un componente de la muestra.

15. Un método de ensayo diagnóstico como el reivindicado en la Reivindicación 14, que comprende las operaciones de:

– poner un material fisiológico aviar en contacto con al menos parte del astrovirus de tipo 3 del pollo,

– incubar el material fisiológico aviar y al menos parte del astrovirus de tipo 3 del pollo de modo que todo anticuerpo presente en la muestra que sea capaz de unirse a al menos parte del astrovirus de tipo 3 del pollo se una a la al menos parte del astrovirus de tipo 3 del pollo, y

– detectar la presencia de dicho anticuerpo unido.

16. Un método de ensayo diagnóstico como el reivindicado en la Reivindicación 14, que comprende las operaciones de:

– poner una muestra de material fisiológico aviar en contacto con un anticuerpo que se une específicamente a al menos parte del astrovirus de tipo 3 del pollo,

– incubar el material fisiológico aviar con dicho anticuerpo de modo que todo astrovirus de tipo 3 del pollo presente en la muestra se una a dicho anticuerpo, y

– detectar la presencia de dicho astrovirus de tipo 3 del pollo presente en la muestra.

17. Un kit diagnóstico para uso en el diagnóstico del astrovirus de tipo 3 del pollo (CAstV-3) , que comprende una sonda, en que dicha sonda es al menos una de:

(a) una secuencia como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. números 1 a 4,

(b) una secuencia que es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas con una porción de la ID. SEC. nº 4

que codifica un polipéptido antigénico capaz de generar una respuesta inmunogénica contra el astrovirus de tipo 3 del pollo,

(c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a una secuencia de nucleótidos como la expuesta mediante la ID. SEC. nº 4, en que dicha secuencia de nucleótidos es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una

proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo, en que la identidad secuencial se refiere al porcentaje de restos de dos secuencias que son idénticos cuando se alinean éstas para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada, en que la ventana de comparación especificada es todos los restos de las secuencias,

(d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 4, en que dicho fragmento es capaz de

codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo,

(e) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos como la expuesta mediante la ID. SEC. nº 4 o un fragmento de la misma, en que dicho fragmento es capaz de codificar una secuencia de aminoácidos de al menos un sitio antigénico proporcionado por una proteína de la cápsida del astrovirus de tipo 3 del pollo, y

(f) un anticuerpo con especificidad ligante hacia un polipéptido de (e) .