Vacuna que comprende un extracto de proteína ribosómica (RPE) y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1.

Uso de un Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania, y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1,

para la preparación de un medicamento, donde dicho Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania se lleva a cabo mediante la realización de los siguientes pasos utilizando una célula de Leishmania 5causante de la Leishmaniasis en caso de que esté presente en el sujeto:

a) se mezcla una célula de Leishmania con un buffer de lisis,

b) se centrifuga la mezcla obtenida para obtener un extracto citosólico,

c) se prepara el Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania a partir del extracto citosólico obtenido sometiendo el extracto citosólico a centrifugación de alta velocidad a 90.000 r.p.m. durante 30 min a 4 °C en un rotor Beckman TL100,3 y resuspendiendo el granulado obtenido en el buffer B constando de 20 mM Tris-HCl, pH 7,4,500 mM AcNH4,100 mM MgCl2,5mM β-mercaptoetanol y centrifugándolo mediante un gradiente discontinuo de sacarosa (20/40%) en el buffer B a 90.000 r.p.m. a 4 °C en un rotor TL100.3.

Vacuna que comprende un extracto de proteína ribosómica (RPE) y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1

Campo de la invención [0001] La invención se refiere a una composición que comprende un extracto de proteína ribosómica (RPE) y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad parasitaria y a su utilización.

Antecedentes de la invención [0002] La leishmaniasis comprende diferentes enfermedades provocadas por protozoos parásitos intracelulares pertenecientes al género Leishmania que infecta principalmente a los macrófagos de una variedad de mamíferos que incluye a perros y humanos. Dependiendo en gran medida de la especie del parásito y del estado de inmunocompetencia del huésped humano, el espectro de la enfermedad comprende desde la leishmaniasis cutánea autocurativa (CL) hasta la leishmaniasis visceral letal (VL) o kala-azar (18) . La leishmaniasis viscerocutánea canina (VCL) provocada por Leishmania infantum y L. chagasi es una importante zoonosis emergente encontrada en países de la cuenca mediterránea, en Oriente Medio y en Latinoamérica (16) considerándose a los perros como el gran asentamiento de dichos parásitos, que juegan un rol principal en la transmisión a humanos por medio de las moscas de arena (47) . El alcance de la infección se determina a través de las interacciones entre el sistema inmunológico que lo alberga y las diferentes especies de parásito. Sin embargo, la patogénesis de la leishmaniasis es incierta y el conocimiento de los mecanismos implicados en la respuesta inmunitaria a la Leishmania en seres humanos y perros sigue siendo limitado. Generalmente, se asocia a la inmunidad protectora con una respuesta inmunitaria mediada por célula clásica que induce a la activación macrófaga por citocinas derivadas de linfocitos T, mientras que se asocia a las enfermedades incurables con la generación de fuertes respuestas humorales (15, 26) . La investigación para el desarrollo de vacunas de segunda generación basadas en partes ordinarias del parásito o en antígenos definidos del parásito se dirigió a la identificación de moléculas de distinta superficie o moléculas secretadas por el parásito que han sido probadas como candidatas para la vacuna en varios modelos experimentales usando diversos adyuvantes (1, 17, 22, 46, 48, 49, 52, 54) . La investigación de bibliotecas de expresión con sueros de animales o humanos infectados también ha permitido la selección de algunos antígenos como candidatos vacunales (visto en (9) ) . Entre estos, aquellos que principalmente obtienen una respuesta inmunitaria de tipo Th1 en las células de ratones infectados o de pacientes humanos independientemente de su ubicación celular, han sido implicados en la generación de respuestas protectoras en distintos modelos de animales (51, 55, 56) . Por otro lado, algunos de los antígenos aislados son proteínas intracelulares conservadas que estimulan principalmente respuestas humorales en humanos o perros que padecen VL o respuestas humorales a través del linfocito Th2 en ratones infectados para la experimentación (3, 36, 38, 40, 42) . Se cree que la respuesta humoral inadecuada provocada contra estos antígenos en perros que sufren leishmaniasis da como resultado una inmunopatología, debido principalmente a los efectos adversos de los complejos inmunes, en particular uveitis (13) , lesiones en el sistema nervioso central (14) o nefritis (23, 24, 33, 34) . También se ha mostrado recientemente que la presencia de complejos inmunes de IgG en seres humanos con VL se correlaciona con la incapacidad para resolver infecciones, lo que demuestra que los complejos inmunes pueden ser perjudiciales para el huésped infectado (30) .

A pesar de no ser consideradas en primer lugar como candidatas vacunales, se ha asociado a las proteínas que inducen altas respuestas humorales durante el proceso infeccioso con la producción de respuestas protectoras. Por ejemplo, tubulinas de parásitos y la histona H2B fueron reconocidas por clones de linfocitos T derivados de un donante inmune (39) y rk39 causa la proliferación y la producción de IFN-y por linfocitos T de ratones inmunes (25) . También se ha mostrado que la inmunización genética con los genes H2B, H3 y H4 del parásito induce protección en modelos murinos de leishmaniasis visceral (27) . También, la inmunización del receptor con quinasa C activada (LACK) (32) , algunas proteinasas de cisteína del parásito (38, 41) o las histonas que forman el nucleosoma del parásito (11, 20) administradas con los adyuvantes promotores de Th1 generan también respuestas inmunológicas que se correlacionan con la protección contra la leishmaniasis cutánea en modelos murinos.

Entre los antígenos conservados evolutivos de Leishmania, diferentes pruebas sugieren que las proteínas ribosómicas son moléculas immunológicamente relevantes en el proceso de Infección por Leishmania. En algunos casos, los constituyentes ribosómicos pueden contribuir a la disfunción del sistema inmunológico del huésped por medio de su capacidad para modular actividades celulares y liberar citocina durante la infección. Así, la inyección de proteína ribosómica S3a de L. major en ratones BALB/c ha provocado la expansión policlonal de clones de linfocitos B y la proliferación de linfocitos T inhibidos (10) . Además, la inmunización genética con una vacuna de ADN codificante para la proteína ribosómica L31 putativa 60S exacerba la enfermedad en ratones por la inducción de las citocinas de IL-10 y Th2 (44, 53) . También se han relacionado algunas proteínas ribosómicas de parásitos como las proteínas P acídicas de parásitos con la generación de fuertes respuestas humorales en perros y seres humanos que padecen leishmaniasis (visto en (42) ) .

US6500437 divulga una vacuna que consta del antígeno ribosómico LbeLF4A.

A pesar de los intentos realizados hasta el momento, continua sin existir una vacuna valiosa contra una enfermedad parasitaria tal como la leishmaniasis. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de dicha vacuna.

Descripción de la invención [0007] En el presente trabajo se muestra que un RPE, especialmente un RPE de Leishmania (LRPE) es un objetivo de la respuesta inmunitaria en perros naturalmente infectados con L. infantum y en ratones experimentalmente infectados con L. major. Demostramos además que se induce una fuerte respuesta inmunitaria protectoraa de Th1 cuando se coadministra un LRPE con un adyuvante promotor de Th1 tales como el oligodesoxinucleótido CpG (ODN) . Dichas composiciones (un LRPE combinado con un adyuvante promotor de Th1) son muy atractivas para su uso como vacuna. La invención será descrita más detalladamente a continuación.

Uso [0008] En un primer aspecto de la invención, se prevé el uso de un RPE y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad parasitaria en un sujeto.

En una forma de realización preferida, se obtiene un RPE utilizando una célula de parásito que causa una enfermedad parasitaria cuando esté presente en un sujeto llevando a cabo los siguientes pasos:

a. se mezcla una célula de parásito con un tampón de lisis,

b. se centrifuga la mezcla obtenida para obtener un extracto citosólico,

c. se prepara un RPE del extracto citosólico obtenido.

En el paso a, un parásito se refiere preferiblemente a un protozoo. Los parásitos preferidos se definirán a continuación aquí. Más preferiblemente, un protozoo se encuentra en la fase de promastigote. El experto en la materia conocerá aproximadamente la cantidad de células de parásito que son necesarias para preparar la cantidad deseada de RPE. De forma típica para preparar aproximadamente 500 microgramos de RPE se usarán en torno a 3.109 células de parásito. Un tampón de lisis es un tampón que descompondrá al menos algunas células del parásito. Un tampón de lisis preferido consta de un tensioactivo no iónico. Se han obtenido buenos resultados con Nonidet P 40 (NP40) como tensioactivo no iónico. No obstante, pueden utilizarse otros tensioactivos no iónicos. Un tampón de lisis preferido usado como se describe a continuación (Tampón A) : 10mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1, 5 mM MgCl2 y 0, 5 % NP40 (Roche) y preferiblemente suplementado con inhibidores de proteasa tales como PMSF 1mM, Leupeptina 8 μg/ml, Aprotinina 4 μg/ml y Pentatina 8 μg/ml) . Típicamente se aplica una cantidad adecuada de células de parásito (aproximadamente 109 células/ml del tampón A) mezclándolas gradualmente con dicho tampón de lisis utilizando una pipeta eppendorf.

En el paso b, se aplica al menos un paso de centrifugación a 4º... [Seguir leyendo]

1. Uso de un Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania, y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1, para la preparación de un medicamento, donde dicho Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania se lleva a cabo mediante la realización de los siguientes pasos utilizando una célula de Leishmania causante de la Leishmaniasis en caso de que esté presente en el sujeto:

a) se mezcla una célula de Leishmania con un buffer de lisis, b) se centrifuga la mezcla obtenida para obtener un extracto citosólico, c) se prepara el Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania a partir del extracto citosólico obtenido sometiendo el extracto citosólico a centrifugación de alta velocidad a 90.000 r.p.m. durante 30 min a 4 º C en un rotor Beckman TL100, 3 y resuspendiendo el granulado obtenido en el buffer B constando de 20 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 500 mM AcNH4, 100 mM MgCl2, 5mM β-mercaptoetanol y centrifugándolo mediante un gradiente discontinuo de sacarosa (20/40%) en el buffer B a 90.000 r.p.m. a 4 º C en un rotor TL100.3.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el medicamento es usado para el tratamiento o la prevención de Leishmaniasis en un sujeto.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el medicamento es una vacuna.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, donde el Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania se obtiene de Leishmania major.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, donde el adyuvante promotor es un ODN CpG.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, donde la enfermedad parasitaria es causada por especies diferentes de las especies de las que se deriva el Extracto de Proteína Ribosómica.

7. Composición para su uso como medicamento, donde dicha composición consta de un Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania, y opcionalmente un adyuvante promotor de Th1, donde el Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania se obtiene mediante la realización de los siguientes pasos usando una célula de Leishmania causante de la Leishmaniasis en caso de estar presente en un sujeto:

a) se mezcla una célula de Leishmania con un buffer de lisis, b) se centrifuga la mezcla obtenida para obtener un extracto citosólico, c) se prepara el Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania a partir del extracto citosólico obtenido sometiéndolo a un centrifugado de alta velocidad a 90.000 r.p.m. durante 30 min a 4 º C en un rotor Beckman TL100.3 y resuspendiendo el granulado obtenido en el buffer B que consta de 20 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 500 mM AcNH4, 100 mM MgCl2, 5mM βmercaptoetanol y centrifugándolo mediante un gradiente discontinuo de sacarosa (20/40%) en el buffer B a 90.000 r.p.m. a 4 º C en un rotor TL100.3.

8. Composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, consistiendo en un Extracto de Proteína Ribosómica de Leishmania y un adyuvante promotor de Th1.

9. Composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación de 7 a 8, donde el adyuvante promotor es un ODN CpG.

10. Composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación de 7 a 9, que consta además de un adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable.

11. Composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación de 7 a 10, donde el medicamento es una vacuna.