Utilización de desaturasas de ácidos grasos de Hemiselmis spp.

Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de:

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4;

b) una secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3;

c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 o un complemento de la misma,en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42 ºC y codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa quedesatura una molécula de ácido graso en el carbono 5; y

d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad de secuencia conla secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 que tiene actividad desaturasa que desatura unamolécula de ácido graso en el carbono 5,

en la que la molécula polinucleotídica está unida operativamente con un promotor heterólogo.

Utilización de desaturasas de ácidos grasos de Hemiselmis spp

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, a enzimas desaturasa que modulan el número y localización de dobles enlaces en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) . En particular, la invención se refiere a la alteración de perfiles de ácidos grasos usando enzimas delta 5 desaturasa y ácidos nucleicos que codifican dichas enzimas desaturasa.

2. Descripción de la técnica relacionada Los productos principales de biosíntesis de ácidos grasos en la mayoría de los organismos son compuestos de 16 y 18 carbonos. La proporción relativa de longitudes de cadena y grado de insaturación de estos ácidos grasos varía ampliamente entre especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen ácidos grasos principalmente saturados y monoinsaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con uno, dos o tres dobles enlaces, comprendiendo los dos últimos ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) .

Las dos familias principales de PUFA son los ácidos grasos omega 3 (también representados como ácidos grasos “n3”) , ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5, n-3) y los ácidos grasos omega-6 (también representados como ácidos grasos “n-6”) , ejemplificados por el ácido araquidónico (ARA, 20:4, n-6) . Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula y el tejido adiposo, en el que pueden encontrarse en formas tales como fosfolípidos y como triglicéridos, respectivamente. Los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado en mamíferos, particularmente en el cerebro infantil en desarrollo, y para la formación y reparación de tejidos. El ácido araquidónico es el principal precursor para la síntesis de eicosanoides, que incluyen leucotrienos, prostaglandinas, y tromboxanos, que también desempeñan un papel significativo en el proceso de inflamación.

Varios trastornos responden al tratamiento con ácidos grasos. Se ha mostrado que la complementación con PUFA reduce la tasa de reestenosis después de angioplastia. Las pruebas indican que los PUFA pueden estar implicados en el metabolismo del calcio, lo que sugiere que los PUFA pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de piedras en el tracto urinario o en el riñón. La mayoría de las pruebas para los beneficios para la salud se aplican a las grasas omega 3 de cadena larga, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6, n-3) que se encuentran en pescado y aceite de pescado.

Los PUFA, tales como ácido linoleico (LA, 18:2, !9, 12) y ácido ∀-linolénico (ALA, 18:3, !9, 12, 15) , se consideran ácidos grasos esenciales en la dieta porque los mamíferos carecen de la capacidad para sintetizar estos ácidos. LA se produce a partir de ácido oleico (OA, 18:1, !9) por una !12-desaturasa mientras que ALA se produce a partir de LA por una !15-desaturasa. Sin embargo, cuando se ingiere, los mamíferos tienen la capacidad de metabolizar LA y ALA para formar las familias n-6 y n-3 de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) . En mamíferos, la formación de LC-PUFA está limitada en su velocidad por la etapa de desaturación !6, que convierte LA a GLA y ALA a SDA. Se ha mostrado que muchas condiciones fisiológicas y patológicas reducen esta etapa metabólica aún más y, en consecuencia, la producción de LC-PUFA. Para superar la etapa de limitación de la velocidad y aumentar los niveles tisulares de EPA, se pueden consumir grandes cantidades de ALA. Como alternativa, evitando la desaturación !6 mediante complementación dietética con EPA o DHA se pueden aliviar eficazmente muchas enfermedades patológicas asociadas con niveles bajos de PUFA. Sin embargo, como se expone en más detalle posteriormente, no son deseables las fuentes disponibles en la actualidad de PUFA.

Los PUFA de cadena larga principales importantes incluyen DHA y EPA, que se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceite de pescado, y ARA, encontrado en hongos filamentosos tales como Mortierella. Para DHA, existen varias fuentes para producción comercial incluyendo una diversidad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces marinos de agua fría y fracciones de yema de huevo. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFA de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA tienden a tener composiciones oleosas altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos de estas fuentes pueden requerir por lo tanto purificación exhaustiva para separar uno o más PUFA deseados o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFA.

Otras limitaciones naturales favorecen un enfoque nuevo para la producción de PUFA. El clima y la enfermedad pueden provocar fluctuación en los rendimientos tanto de fuentes de pescado como de otras marinas. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella es cara. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARN y son difíciles de procesar.

Sumario de la invención Un aspecto de la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 5, seleccionándose dicha secuencia de ácido nucleico de a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; b) una secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 o un complemento de la misma, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42 ºC y codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5,

en el que la molécula polinucleotídica está unida operativamente a un promotor heterólogo. Estos ácidos nucleicos pueden usarse para transformar células o modificar la composición de ácidos grasos de una planta o el aceite producido por una planta. Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan secuencias polinucleotídicas aisladas de Hemiselmis spp. que tienen una actividad desaturasa única. En una realización particular de la invención, los polinucleótidos codifican un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4, incluyendo al menos 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98% y 99% de identidad con esas secuencias. Los expertos en la materia reconocerán que, ya que estas secuencias están relacionadas, un polipéptido dado puede compartir simultáneamente el 75% o más identidad de secuencia con más de una de estas secuencias polipeptídicas. En ciertas realizaciones, una desaturasa de Hemiselmis spp. de la invención se define adicionalmente como una omega 3 !5 desaturasa (es decir, una desaturasa con una preferencia de sustrato de omega 3) .

En otra realización particular se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; (c) un polinucleótido que hibrida con SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3, o un complemento del mismo, en condiciones de SSC 5X, formamida 50% y 42 ºC; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 75%, 85%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; y e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos uno de los motivos de aminoácidos: LeuPheGlyGlyAsnAspValSerValGlnTyrArgMetIle (LFGGNDVSVQYRMI) (SEC ID Nº: 15) ; IleAlaIleGlyMetSerGlnAlaSerIleGlyLeuAsnValGln (IAIGMSQASIGLNVQ) (SEC ID Nº: 16) ; GlyAlaAspMetIleGlyGlyCysLysTyrLeuTrpLeuGln (GADMIGGCKYLWLQ) (SEC ID Nº: 17) ; AlaSerSerThrAspProPhePheLeuPheHisAspTyrGlyLys (ASSTDPFFLF-HDYGK) (SEC ID Nº: 18) ; LeuAlaMetTyrTrpAlaSerSerIlePheAsnThrAsnValValThrLeuGlnHis (LAMYWASSIFNTNV-VTLQH) (SEC ID Nº: 19) ; AsnSerTyrArgGluAlaHisArgProIleSerIle (NSYREAHRPISI) (SEC ID Nº: 20) ; HisValTrpThrMetAlaValSerGluSerLeuThr (HVWTMAVSESLT) (SEC ID Nº: 21) ; LeuAlaIleProPheAlaLeuSerHisAsnPhe (LAIP-FALSHNF) (SEC ID Nº: 22) ; o GlnProAlaValArgGluValCysLysLysHisGlyValAsnTyrVal... [Seguir leyendo]

1. Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de:

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4; b) una secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3; c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 o un complemento de la misma, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42 ºC y codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5; y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5,

en la que la molécula polinucleotídica está unida operativamente con un promotor heterólogo.

2. La molécula polinucleotídica de la reivindicación 1, que comprende

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4;

(ii) una secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3;

(iii) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 o un complemento de la misma, en condiciones de SSC 5X, formamida al 50% y 42 ºC y codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5; o

(iv) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 5, o

(v) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos uno de los motivos de aminoácidos seleccionados de: SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº: 23.

3. La molécula polinucleotídica de la reivindicación 1, que comprende además al menos una secuencia polinucleotídica adicional que codifica elongasa o desaturasa de ácidos grasos.

4. La molécula polinucleotídica de la reivindicación 1, en la que el promotor heterólogo es un promotor potenciado en semillas.

5. Una célula huésped transformada con la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, en la que

(i) la célula huésped es una célula vegetal, una célula fúngica o célula bacteriana; o

(ii) la célula huésped muestra biosíntesis de ácidos grasos alterada en relación con una célula del mismo genotipo que dicha célula huésped pero que carece de dicha molécula polinucleotídica; o

(iii) la célula ha heredado dicha molécula polinucleotídica de un progenitor de la célula.

7. Una planta transgénica o parte de la planta transformada con la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.

8. La planta transgénica o parte de planta de la reivindicación 7 en la que la planta es seleccionada de canola, Brassica campestris, colza oleaginosa, colza, soja, crambe, mostaza, semilla de ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón, linaza, cártamo, palma aceitera, lino, girasol, maíz, arroz, cebada, mijo, centeno, trigo, avena, alfalfa y sorgo.

9. La planta transgénica o parte de planta de la reivindicación 7, que comprende además al menos un polinucleótido adicional que codifica una desaturasa o elongasa de ácidos grasos, preferentemente la planta transgénica o parte de planta comprende además un polinucleótido que codifica una !6 desaturasa, una !6 elongasa, una !18 elongasa, una !15 desaturasa, una !9 elongasa, una !8 desaturasa, una !17 desaturasa, una !4 desaturasa o una C20 elongasa.

10. Una planta descendiente de la planta transgénica de la reivindicación 7, en la que la planta descendiente comprende dicha molécula polinucleotídica.

11. Una semilla de una planta transgénica de la reivindicación 7, en la que la semilla comprende dicha molécula polinucleotídica.

12. Un procedimiento de producción de una composición de alimento o pienso, que comprende las etapas de:

(a) obtener la planta transgénica o parte de planta de acuerdo con la reivindicación 7; y

(b) producir dicha composición de alimento o pienso.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el alimento o pienso es aceite, ensilaje, sémola, grano, almidón, harina o proteína.