Uso de substrato blando microimpreso para la medida de fuerzas de tracción celular.

Un método para medir una fuerza de tracción celular de una célula, que comprende:

- proporcionar un dispositivo que comprende un substrato blando plano con un módulo de Young de alrededor de 0,1 a 100 kPa, que tiene dispuesto sobre él un micropatrón adhesivo que tiene una forma apropiada para concentrar reproduciblemente la fuerza de tracción celular en una única región o punto, en el que:

- el tamaño de dicho micropatrón adhesivo es tal que se puede adherir una sola célula; y

- dicho micropatrón adhesivo incluye un área adhesiva que comprende un área de expansión adhesiva y dos conjuntos de dos puntos adhesivos, en el que

(a) los puntos adhesivos están sobre o cerca de la envoltura convexa del micropatrón adhesivo;

(b) cada conjunto contiene un punto sobre cada lado de un eje en el plano de la envoltura convexa;

(c) los dos puntos localizados en el mismo lado del eje están separados por una región no adhesiva que forma entre 15% y 35% de la longitud total de la envoltura convexa;

(d) el primer conjunto de puntos adhesivos está esencialmente localizado cerca o sobre el eje para formar una región adhesiva de no más del 10% de la longitud total de la envoltura convexa; y

(e) el área de expansión adhesiva está dispuesta sobre cada lado del eje entre el segundo conjunto de puntos adhesivos para conectar los dos puntos y hacia el primer conjunto de puntos adhesivos entre las dos regiones no adhesivas de c),

- exponer el substrato a por lo menos una célula durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que una célula se una al micropatrón adhesivo;

- medir la posición de dicha única región o punto de dicho micropatrón; y;

- calcular el desplazamiento de dicha única región o punto de dicho micropatrón, determinando por ello la fuerza de tracción celular.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11305123.

Solicitante: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: BATIMENT "LE PONANT D" 25, RUE LEBLANC 75015 PARIS FRANCIA.

Inventor/es: THERY,MANUEL, TSENG,QINGZONG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))

PDF original: ES-2538985_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Uso de substrato blando microimpreso para la medida de fuerzas de tracción celular

Campo de la invención La presente invención se refiere a un dispositivo y método para la medida de fuerzas de tracción celular

Antecedentes de la invención La homeostasis tisular es muy dependiente de la organización espacial celular y del equilibrio mecánico. Las células se unen a su micromedio y ejercen fuerzas de tracción vía la contracción dependiente de miosina de su citoesqueleto de actina. Se ha mostrado recientemente que el nivel de contracción celular tiene un impacto drástico en la fisiología celular. Dirige la diferenciación de las células madre (Engler et al., 2006, Cell 126, 677-689) . También promueve el crecimiento celular y se ha mostrado que es responsable de la transformación tumoral (Paszek et al., 2005, Cancer Cell 8, 241-254) . Es necesario de este modo desarrollar métodos fiables y fáciles de emplear para medir el nivel de contracción celular.

Los dos métodos principales para medir las fuerzas de tracción celular están basados en la deformación del substrato de cultivo celular. Ambos tienen limitaciones en la fabricación del substrato y el análisis de la fuerza.

Entre los diferentes métodos desarrollados para la medida de fuerzas, la microscopia de fuerza de tracción (TFM) es uno de los más usados. Sin embargo, debido a su bastante complicada etapa de procesamiento de datos, esta técnica aún es exclusiva de algunos grupos especializados. No obstante todos los materiales necesarios para realizar TFM son casi equipos y reactivos de rutina en un laboratorio biológico ordinario.

La TFM clásica propuesta por Dembo and Wang (1999, Biophys J 76, 2307-2316) se realizaba en gel de poliacrilamida (PAA) . Básicamente, el gel de PAA se preparaba con micropartículas fluorescentes incorporadas dentro. A continuación, el gel se activaba con reticuladores químicos (por ejemplo, Sulfo-SANPAH) y se revestía homogéneamente con proteína de matriz extracelular (ECM) para hacer el gel disponible para adhesión celular. Cuando las células se unían al gel, debido a la fuerza de tracción ejercida por la célula, el substrato blando se deformaba y de este modo las partículas se desplazaban. Comparando la imagen de las partículas desplazadas y otra imagen de la posición original de las partículas tomada después de separar la célula (por ejemplo, por tratamiento con tripsina) , se puede obtener el campo de desplazamiento. La fuerza de tracción se podría por lo tanto obtener resolviendo un problema inverso desplazamiento-fuerza.

Debido a la colocación al azar de las partículas de marcador de referencia, una imagen de la posición de las partículas relajadas, que se puede obtener solo después de separar la célula, se requiere siempre para obtener el campo de desplazamiento. Esto prohíbe la inmediata visualización de la tracción celular. Además, el seguimiento de las partículas colocadas al azar entre imágenes tensionadas y relajadas inevitablemente requiere intervención manual para corregir la falsa detección y unión de partículas que consume bastante tiempo. Este método requiere largos cálculos numéricos y regularizaciones específicas del caso para deducir el campo de fuerzas de tracción del campo de deformación del gel. Además, la activación del gel de PAA con sulfo-SANPAH es una etapa bastante variable que da como resultado una activación no homogénea y no reproducible del substrato. La medida experimental del desplazamiento de las partículas fluorescentes es muy sensible al desplazamiento del foco (Marganski et al., 2003, Methods Enzymol 361, 197-211) . Los subsecuentes defectos en el seguimiento automatizado de partículas conducen a grandes errores en la medida de las fuerzas (Sabass et al., 2008, Biophys J 94, 207-220) .

Los errores asociados a la detección de partículas se podrían superar usando un conjunto de puntos microimpreso sobre la superficie del gel (Balaban, 2001, Nat Cell Biol 3, 466-472) .

Un segundo método, cultivo celular sobre pilares microfabricados, permite un cálculo de la fuerza mucho más simple y de este modo más rápido. Este método está basado en el uso de un substrato recubierto por un microconjunto tridimensional de pilares (o líneas) flexibles que actúan como sensor y revestido con proteínas adhesivas para permitir que las células se expandan. Las fuerzas aplicadas por las células sobre el substrato se determinan por medio de la medida de la desviación de los pilares. Este método se describe, entre otros, en du Roure et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102, 2390-2395; Tan et al., 2003, Proc Natl Acad Sci Usa 100, 1484-1489, Ghibaudo et al. Lab on Chip, 2011, 805-812, Buguin et al. Medecine/Science 2005, 21, 765-767, Saez et al. Journal of Physics Condensed Matter, 2010, 1-9. Sin embargo el substrato requiere varias etapas de microfabricación no triviales. Además, los micropilares no soportan la desecación del disolvente, y la topografía del substrato puede afectar al comportamiento celular.

Con ambas técnica, las células se pueden mover libremente sobre el substrato. Por lo tanto, adoptan todo tipo de formas. Esta ausencia de restricciones geométricas imposibilita cualquier procedimiento automatizado para la medida de la fuerza celular. Por lo tanto no son apropiadas para experimentos a gran escala.

El control de la forma celular usando micropatrones adhesivos es un método eficiente para superar las anteriormente

mencionadas limitaciones. Azioune et al. (Methods in Cell Biology, 2010, 97, 133-146) describen un método para preparar micropatrones de proteína por medio de un protocolo de impresión directa usando UVs profundos.

De hecho, los micropatrones adhesivos revestidos con ECM permiten la normalización de la forma de la célula individual y un control preciso de la distribución espacial de la adhesión focal y cables de actina (Parker et al., 2002, FASEB J 16, 1195-1204; Ther y et al., 2006, Cell Motil Cytoskeleton 63, 341-355; Ther y et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 19771-19776) . Las geometrías apropiadas pueden imponer exigentes restricciones de orientación al ensamblaje de actina, reducir la variabilidad célula-célula y simplificar el método de cálculo de fuerzas controlando la localización de la aplicación de la fuerza.

La microimpresión sobre gel de PAA se ha realizado con estarcidos (Parker et al., 2002, supra; Wang et al., 2002, Cell Motil Cytoskeleton 52, 91-106) , o sellos microestructurados (engler et al., 2004, Cell 126, 677-689; Tan et al., 2003, supra) , pero la resolución del micropatrón es relativamente baja.

En ambos casos, la microimpresión requiere varias etapas de microfabricación, haciendo todo el procedimiento largo y difícil de realizar. Además, las geometrías de patrón que se han intentado hasta ahora no proporcionaron un control preciso del campo de fuerza celular.

La extracción de la fuerza de los datos de desplazamiento aún requiere cálculo no trivial. Además del cálculo numérico no triviales, la forma y distribución de fuerza celular eran muy variables. Esto hace imposible el análisis cuantitativo a gran escala. En particular, la medida de fuerzas se hacía aun a partir del desplazamiento de partículas, teniendo de este modo los inconvenientes mencionados anteriormente. Aunque se controlaba la forma de la célula, las geometrías escogidas en su trabajo no podían regularizar la distribución de la fuerza de tracción. De este modo, las fuerzas aún estaban distribuidas al azar, y la deformación del substrato era compleja y diferente de una célula a otra.

Sumario de la invención El principal objetivo de esta invención es simplificar, automatizar y acelerar la medida de la fuerza de tracción usando micropatrones adhesivos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para medir una fuerza de tracción celular de una célula, que comprende:

-proporcionar un dispositivo que comprende un substrato blando plano con un módulo de Young de alrededor de 0, 1 a 100 kPa, que tiene dispuesto sobre él un micropatrón adhesivo que tiene una forma apropiada para concentrar reproduciblemente la fuerza de tracción celular en una única región o punto, en el que:

-el tamaño de dicho micropatrón adhesivo es tal que se puede adherir una sola célula; y

-dicho micropatrón adhesivo incluye un área adhesiva que comprende un área de expansión adhesiva y dos conjuntos de dos puntos adhesivos, en el que

(a) los puntos adhesivos están sobre o cerca de la envoltura convexa del micropatrón adhesivo;

(b) cada conjunto contiene un punto sobre cada lado de un eje en el plano de la envoltura convexa;

(c) los dos puntos localizados en el mismo lado del eje están separados por una región no adhesiva que forma entre 15% y 35% de la longitud total de la envoltura convexa;

(d) el primer conjunto de puntos adhesivos está esencialmente localizado cerca o sobre el eje para formar una región adhesiva de no más del 10% de la longitud total de la envoltura convexa; y

(e) el área de expansión adhesiva está dispuesta sobre cada lado del eje entre el segundo conjunto de puntos adhesivos para conectar los dos puntos y hacia el primer conjunto de puntos adhesivos entre las dos regiones no adhesivas de c) ,

-exponer el substrato a por lo menos una célula durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que una célula se una al micropatrón adhesivo;

-medir la posición de dicha única región o punto de dicho micropatrón; y;

-calcular el desplazamiento de dicha única región o punto de dicho micropatrón, determinando por ello la fuerza de tracción celular.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la fuerza de tracción celular se determina a partir de una curva de calibración que muestra la relación entre la fuerza de tracción celular y el desplazamiento de dicha única región o punto de dicho micropatrón.

3. Un dispositivo para medir una fuerza de tracción celular de una sola célula, en el que el dispositivo comprende un substrato blando plano con un módulo de Young de alrededor de 0, 1 a 100 kPa y dispuesto sobre él un micropatrón adhesivo que tiene una forma apropiada para concentrar reproduciblemente la fuerza de tracción celular sobre una única región o punto, en el que:

-el tamaño de dicho micropatrón adhesivo es tal que se puede adherir una sola célula; y

-dicho micropatrón adhesivo incluye un área adhesiva que comprende un área de expansión adhesiva y dos conjuntos de dos puntos adhesivos, en el que

(a) los puntos adhesivos están sobre o cerca de la envoltura convexa del micropatrón adhesivo;

(b) cada conjunto contiene un punto sobre cada lado de un eje en el plano de la envoltura convexa;

(c) los dos puntos localizados en el mismo lado del eje están separados por una región no adhesiva que forma entre 15% y 35% de la longitud total de la envoltura convexa;

(d) el primer conjunto de puntos adhesivos está esencialmente localizado cerca o sobre el eje para formar una región adhesiva de no más del 10% de la longitud total de la envoltura convexa; y

(e) el área de expansión adhesiva está dispuesta sobre cada lado del eje entre el segundo conjunto de puntos adhesivos para conectar los dos puntos y hacia el primer conjunto de puntos adhesivos entre las dos regiones no adhesivas de c) .

4. El método de la reivindicación 1 o 2 o el dispositivo de la reivindicación 3, en el que la célula es una célula humana o animal.

5. El método o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el micropatrón es un micropatrón como se define en la Fig. 1B.

6. El método o dispositivo de la reivindicación 5, en el que el micropatrón adhesivo tiene una forma de ballesta.

7. El método o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el la única región o punto está marcada, preferentemente marcada por fluorescencia.

8. El método o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el substrato comprende varios micropatrones adhesivos, idénticos o diferentes.

9. El método o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el substrato blando es un gel de poliacrilamida.

10. El método o dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el substrato blando tiene un 10 módulo de Young de alrededor de 1 a alrededor de 10 kPa.

11. Un kit para medir una fuerza de tracción celular de una célula, comprendiendo dicho kit un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 3-10 y una curva de calibración que muestra la relación entre la fuerza de tracción celular y el desplazamiento de dicha única región o punto del micropatrón.

12. El uso de un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para medir una fuerza de 15 tracción celular de una célula.

13. Un método para determinar el efecto de una molécula candidata/de ensayo sobre la fuerza de tracción de una célula, que comprende:

-medir la fuerza de tracción de una célula por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4-9;

-medir la fuerza de tracción de la célula incubándola con la molécula candidata/de ensayo por el método de una 20 cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4-9; y,

-comparar la fuerza de tracción de la célula incubándola o no con la molécula candidata/de ensayo, determinando por ello el efecto de la molécula candidata/de ensayo sobre la fuerza de tracción de la célula.

14. Un método para determinar la diferencia de tracción celular de dos tipos de células, que comprende: -medir la fuerza de tracción de un primer tipo de células por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 25 y 4-9;

-medir la fuerza de tracción de un segundo tipo de células por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4-9; y -comparar la fuerza de tracción del primer y segundo tipo de células, determinando por ello la diferencia de tracción

celular de los dos tipos de células. 30