USO DE RIBOZIMAS EN LA DETECCIÓN DE AGENTES ADVENTICIOS.

Esta invención se refiere a un método para detectar agentes adventicios en una composición que incluye un reovirus. WO 01/72964 describe una metodología basada en PCR cuantitativa para detectar agentes adventicios dentro de muestras derivadas de materiales biológicos pero no menciona el uso de células que expresan ribozimas en el método. En el campo de las ciencias médicas o biológicas, siempre ha existido la demanda para producir grandes cantidades de microorganismos tales como virus, bacterias, levaduras, otros hongos, parásitos y priones. Los microorganismos resultantes pueden utilizarse para aislar y purificar proteínas microbianas, generar vacunas o proporcionar microorganismos infecciosos para estudios en laboratorio o estudios médicos. Recientemente, el nuevo desarrollo de la terapia con virus ha aumentado el requerimiento de una producción eficiente de virus infecciosos. Los tratamientos con reovirus (Patente de EE.UU.No. 6,136,307) es un ejemplo de la terapia con virus. Reovirus es un virus de ARN de doble cadena con un genoma segmentado. El receptor para el reovirus de mamífero es una molécula ubicua, por lo tanto el reovirus es capaz de unirse a una multitud de células. Sin embargo, la mayoría de las células no son susceptibles a la infección por reovirus y la unión de un reovirus a su receptor celular no produce replicación viral ni producción de partículas de virus. Esta es probablemente la razón por la cual el reovirus no se conoce que esté asociado con ninguna enfermedad determinada. Se ha descubierto recientemente que las células transformadas con el oncogen ras se vuelven susceptibles a infección por reovirus, mientras que las no transformadas no lo son (Strong et al., 1998). Por ejemplo, cuando las células NIH 3T3 resistentes a reovirus se transforman con Ras o Sos activados, una proteína que activa Ras, la infección con reovirus es más intensa. De manera similar, los fibroblastos de ratón que son resistentes a infección por reovirus se vuelven susceptibles después de la transfección con el gen receptor de EGF o el oncogen -erbB, los cuales activan la ruta ras (Strong et al., 1993; Strong et al., 1996). De esta manera, el reovirus puede infectar selectivamente y eliminar células con una ruta activada ras. La activación de la ruta RAS explica un gran porcentaje de los tumores de mamíferos. La activación de mutaciones del gen ras por sí mismo ocurren en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas pancreáticas (90%), colorrectal esporádico (50%) y pulmonar (40%), así como leucemia mieloide (30%). La activación de factores corriente arriba o corriente abajo en la ruta ras también se asocia con tumores. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2/Neu/ErbB2 o del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es común en el cáncer de mama (25-30%), y la sobreexpresión del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del receptor de EGF es frecuente en gliomas y glioblastomas (40-50%). Se saben que los receptores del EGF y del PDGF activan el ras durante la unión a su respectivo ligando, y -erbB codifica un receptor constitutivamente activado que carece de dominio extracelular. En consecuencia, la terapia con reovirus, que es altamente selectiva para células tumorales asociadas a ras, y se puede usar para tratar una amplia variedad de tumores. El reovirus se puede producir y purificar en preparaciones a granel (Publicación de Solicitud de Patente número 2002/0037576 A1). Para garantizar que la preparación de reovirus no contenga los agentes adventicios que pueden provocar efectos secundarios no deseados, la preparación se valida mediante el uso de una línea de células susceptibles y anticuerpos anti-reovirus. Por lo tanto, la línea celular está expuesta solamente a la preparación de virus, o a la preparación de virus que se ha neutralizado por un anticuerpo neutralizante específico de reovirus. Si la preparación de virus de anticuerpo neutralizado es aún patogéna para la línea celular, la preparación de virus debe contener un virus adventicio u otro organismo. La preparación es purificada adicionalmente o se descarta. Este protocolo de validación es caro, ya que requiere grandes cantidades altos títulos de anticuerpos de alta afinidad para neutralizar el virus. Este problema se agrava aún más en la actualidad, ya que podemos producir muy eficientemente reovirus, y la necesidad de anticuerpos es aún mayor. Por lo tanto, es deseable un enfoque más rentable. La presente invención proporciona un método de validación de preparaciones microbianas utilizando una ribozima que es específica para el microorganismo que se prepara. Por ejemplo, un plásmido que codifica una ribozima que escinde específicamente el genoma de reovirus se puede introducir en las células que son susceptibles a la infección de reovirus. Las células transfectadas, expresando la ribozima, son capaces de inactivar el reovirus y así no serán infectadas por el virus. Las células que expresan la ribozima se someten a continuación a una preparación de reovirus, y cualquier efecto patogéno causado por la preparación de reovirus indicará que en la preparación de reovirus está presente un agente adventicio. Por el contrario, la ausencia de cualquier efecto patogéno valida la preparación como libre de agentes adventicios detectables. Este método también es aplicable a virus u otros microorganismos que tienen un genoma de ADN. Ya que el 2 E03704136 21-10-2011   genoma de ADN debe transcribirse a ARN para una infección satisfactoria por el microorganismo, una ribozima específica para el transcripto de ARN inhibirá la infección así como la replicación del microorganismo. Una vez más, si las células que expresan el ribozima muestran cualquier efecto patogeno debido a la preparación microbiana, debe estar presente un agente adventicio en la preparación. Del mismo modo, este método también se puede utilizar para validar preparaciones de los priones. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de un agente adventicio en una composición que contiene un reovirus, que comprende: (a) proporcionar una población de células indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar específicamente el genoma del reovirus. (b) contactar las células indicadoras con la composición en condiciones que permitan la escisión del genoma del reovirus por la ribozima; y (c) determinar el efecto de la composición en las células indicadoras, en donde cualquier efecto patógeno indica la presencia de un agente adventicio en la composición además del reovirus. Las células pueden expresar la ribozima transitoriamente o permanentemente. Preferentemente, las células contienen un gen que codifica una ribozima que se integra en el genoma de las células. La ribozima puede escindir cualquier parte del genoma del reovirus que es importante para la replicación o infección por reovirus. Por ejemplo, la ribozima puede escindir el segmento S1 del reovirus, tal como Rz-553 o Rz-984. Este método se puede utilizar para detectar agentes adventicios en cualquier reovirus. El reovirus preferiblemente es un reovirus de mamífero, más preferiblemente un reovirus de serotipo 3 y siendo el más apropiado un reovirus de cepa Dearing. El reovirus puede ser un reovirus recombinante. El reovirus recombinante se puede generar por co- infección de células de mamífero con diferentes subtipos de reovirus. El reovirus recombinante puede ser de origen natural o no natural. El reovirus recombinante puede ser de dos o más cepas de reovirus, particularmente dos o más cepas de reovirus seleccionadas del grupo que consta de las cepas Dearing, Abney, Jones y Lang. El reovirus recombinante puede también proceder de la redistribución de reovirus de diferentes serotipos, tales como los seleccionados del grupo que consta de reovirus de serotipo 1, reovirus de serotipo 2 y reovirus de serotipo 3. El reovirus recombinante puede estar constituído por secuencias de codificación de proteínas de capa variante de origen natural o secuencias de codificación de proteínas de capa mutada. La presente invención puede aplicarse a composiciones de cualquier microorganismo, incluyendo cualquier virus. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de un agente adventicio en una composición que comprende un virus en donde el virus contiene un genoma de ARN o utiliza un transcripto de ARN para replicarse, que comprende: (a) proporcionar una población de células indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar específicamente el genoma de ARN o transcripto de ARN del virus. (b) contactar las células indicadoras con la composición en condiciones que permitan la escisión del genoma de ARN o transcripto de ARN... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de un agente adventicio en una composición que comprende un reovirus, que comprende:

(a) proporcionar una población de células indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de segmentar específicamente el genoma del reovirus;

(b) poner en contacto las células indicadoras con la composición en condiciones que permiten la segmentación del genoma del reovirus por la ribozima;

(c) determinar el efecto de la composición sobre las células indicadoras, donde cualquier efecto patógeno indica la presencia de un agente adventicio en la composición además del reovirus.

2. El método de la reivindicación 1, donde las células indicadoras expresan la ribozima de un gen que se integra en el genoma de las células.

3. El método de la reivindicación 1, donde la ribozima es capaz de segmentar específicamente el ARN s1 del reovirus.

4. El método de la reivindicación 1, donde la ribozima es Rz-553 o Rz-984.

5. El método de la reivindicación 1, donde el reovirus es un reovirus mamífero.

6. El método de la reivindicación 1, donde el reovirus es un reovirus humano.

7. El método de la reivindicación 1, donde el reovirus es un reovirus de la cepa Dearing.

8. El método de la reivindicación 1, donde el reovirus es un reovirus recombinante.

9. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante se genera por co-infección de células mamíferas con diferentes subtipos de reovirus.

10. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante es de origen natural.

11. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante es de origen no natural.

12. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante es de dos o más cepas de reovirus.

13. El método de la reivindicación 12, donde las dos o más cepas de reovirus se seleccionan del grupo formado por la cepa Dearing, la cepa Abney, la cepa Jones y la cepa Lang.

14. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante se obtiene como resultado del reagrupamiento de reovirus seleccionados del grupo que consiste en reovirus del serotipo 1, reovirus del serotipo 2 y reovirus del serotipo 3.

15. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante comprende secuencias codificantes de la proteína de la cubierta de la variante natural.

16. El método de la reivindicación 8, donde el reovirus recombinante comprende secuencias codificantes de la proteína de la cubierta mutada.

17. Un método para detectar la presencia de un agente adventicio en una composición que comprende un virus donde el virus contiene un genoma de ARN o utiliza un transcrito de ARN para replicarse, que comprende:

(a) proporcionar una población de células indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de segmentar específicamente el genoma de ARN o el transcrito de ARN del virus para inhibir la replicación o infección del virus;

(b) poner en contacto las células indicadoras con la composición en condiciones que permiten la segmentación del genoma de ARN o del transcrito de ARN del virus por la ribozima; y

(c) determinar el efecto de la composición sobre las células indicadoras, donde cualquier efecto patógeno indica la presencia de un agente adventicio en la composición además del virus.

18. El método de la reivindicación 17, donde las células indicadoras expresan la ribozima de un gen que se integra en el genoma de las células.

19. El método de la reivindicación 17, donde el virus es un virus de ADN.

20. El método de la reivindicación 17, donde el virus es capaz de infectar selectivamente células neoplásicas.

21. El método de la reivindicación 17, donde el virus se selecciona del grupo que consiste en adenovirus modificado, HSV modificado, virus vaccinia modificado, virus de pseudoviruela modificado, virus orf, virus influenza modificado, virus que expresan p53, el virus ONYX-015, el virus Delta24, y virus de la estomatitis vesicular.

22. Un método para validar una composición que comprende un microorganismo, que comprende:

(a) proporcionar una población de células indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de segmentar específicamente el genoma de ARN o el transcrito de ARN del microorganismo para inhibir la replicación o infección del microorganismo;

(b) poner en contacto las células indicadoras con la composición en condiciones que permiten la segmentación del genoma de ARN o del transcrito de ARN del microorganismo por la ribozima; y

(c) determinar el efecto de la composición sobre las células indicadoras, donde la ausencia de cualquier efecto patógeno valida a la composición como carente de agente adventicio detectable.

23. El método de la reivindicación 13, donde el microorganismo es un virus.

24. El método de la reivindicación 13, donde el microorganismo es un virus capaz de infectar selectivamente células neoplásicas.

25. El método de la reivindicación 13, donde el microorganismo es un reovirus.

26. El método de la reivindicación 13, donde el microorganismo se selecciona del grupo formado por adenovirus modificado, HSV modificado, virus vaccinia modificado, virus de pseudoviruela modificado, virus orf, virus influenza modificado, virus que expresan p53, el virus ONYX-015, el virus Delta 24, y virus de la estomatitis vesicular.

27. Una célula indicadora útil para detectar un agente adventicio en una composición de microorganismo donde la célula indicadora expresa permanentemente una ribozima que es capaz de segmentar el genoma o el transcrito de ARN del microorganismo.

28. La célula indicadora de la reivindicación 27, donde un gen codificante para la ribozima se integra en el genoma de la célula.

29. La célula indicadora de la reivindicación 27, donde el microorganismo es un virus.

30. La célula indicadora de la reivindicación 27, donde el microorganismo es reovirus.

31. La célula indicadora de la reivindicación 27, donde la célula se deriva de células renales embrionarias humanas 293.