Uso de una ribonucleasa de la familia T2 que tiene actividad de unión a actina para inhibir y/o invertir la proliferación.

Una ribonucleasa de la familia T2 para uso en la prevención, la inhibición y/o la inversión de la proliferación,

lacolonización, la diferenciación y/o el desarrollo de células tumorales en un sujeto en donde dicha ribonucleasa de lafamilia T2 es RNasa B1 y estando dicha ribonucleasa desprovista de actividad ribonucleolítica.

Uso de una ribonucleasa de la familia T2 que tiene actividad de unión a actina para inhibir y/o invertir la proliferación La presente invención se refiere a una ribonucleasa de la familia T2 para su uso en la prevención del desarrollo de tumores de acuerdo con la reivindicación 1, una ribonucleasa de la familia T2 para su uso en la inhibición de 5 angiogénesis de un tumor de acuerdo con la reivindicación 8.

La presente divulgación se refiere al uso de una ribonucleasa de la familia T2 o un polinucleótido que la codifica para prevenir, inhibir y/o invertir la proliferación, la colonización, la diferenciación y/o el desarrollo de células que proliferan de forma anómala en un sujeto. La presente divulgación se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, una ribonucleasa de la familia T2 o un polinucleótido que la codifica para tratar enfermedades o trastornos proliferativos en general y cáncer en particular.

Existe un interés continuado, tanto dentro de la comunidad médica como entre la población general, en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos proliferativos celulares tales como cáncer.

Los agentes que presentan propiedades antiproliferativas, anticolonización, antidiferenciación y/o antidesarrollo frente a células de mamífero pueden potencialmente usarse como fármaco antineoplásicos. Como tales, estos agentes se buscan ampliamente desde fuentes tanto naturales como sintéticas.

Las RIBASAS son ribonucleasas (RNasas) que presentan una actividad biológica que es distinta de su capacidad para degradar ARN. Se sabe que las RIBASAS y sus homólogos estructurales efectúan un gran número de reacciones celulares (Rybak, M. y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207; Schein, C. H. 1997 Nature Biotechnol. 15: 529-536) . Se cree que EDN y ECP, dos proteínas principales halladas en los gránulos secretores de eosinófilos citotóxicos (miembros de la familia de RNasa A) participan en la respuesta inmune. Las S-RNasas estilares de plantas autoincompatibles (miembros de la familia de RNasa T2) , detienen el crecimiento del tubo polínico y de este modo evitan la fertilización. La RC-RNasa, producida por oocitos de rana toro, inhibe, in vitro, el crecimiento de células tumorales tales como las líneas celulares de leucemia P388 y L1210 y es eficaz para la 25 destrucción in vivo de células de sarcoma 180, Erlich y líquido ascítico Mep II (Chang, C-F. y col 1988, J. Mol Biol

283: 231-244) . Algunas RNasas presentan actividad ribonucleasa limitada, un ejemplo de la cual incluye angiogeninas que estimulan la formación de vasos sanguíneos (Fett, J. W. 1985, Biochemistr y 24: 5480-5486) .

Los organismos vivos usan RNasas extracelulares para defensa contra patógenos y células tumorales. Por ejemplo, se secreta ECP en respuesta a ataque de parásitos (Newton, DL. 1992, J. Biol. Chem. 267: 19572-19578) y presenta actividad antibacteriana y antiviral. Esta actividad también se presenta por Cinc-a2-glicoproteína (Zna2gp) , una RNasa presente en la mayoría de los fluidos corporales humanos incluyendo sangre, plasma seminal, leche materna, fluido sinovial, saliva, orina y sudor (Lei G, y col., 1998, Arch Biochem Biophys. 15 Jul; 355 (2) : 160-4) .

Se desconoce el mecanismo específico por el que las RNasas extracelulares actúan en reacciones celulares.

La principal barrera para la actividad citotóxica de algunas RNasas es la membrana celular. Se ha descubierto que ECP forma canales en membranas tanto artificiales como celulares. Supuestamente, ECP liberada de la membrana granular junto con EDN (RNasa eosinófila, que es responsable de la destrucción de células de Purkinjie cerebelares) transfiere EDN al espacio intercelular. La entrada de la toxina fúngica a-sarcina (un miembro de la familia de RNasa A) en células diana depende de infección viral que permeabiliza la membrana celular (Rybak, M. y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207) . También es posible que las RNasas entren en la célula mediante endocitosis. Cuando se usaron los fármacos que alteran el Golgi ácido retinoico o monensina para suministrar de forma artificial BS-RNasa a las células, la citotoxicidad aumentó drásticamente (Wu Y, y col., 1995, J Biol Chem. 21; 270 (29) : 17476-81) .

Puede usarse la citotoxicidad de las RNasas para fines terapéuticos. La RNasa humana L se activa por interferón e inhibe el crecimiento viral. La expresión del gen para RNasa L humana junto con el de una 2’5’-A sintetasa en plantas del tabaco es suficiente para proteger a las plantas de virus del mosaico del pepino y para evitar la 45 replicación del virus de la patata Y. El virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) induce bloqueo en las rutas antivirales de RNasa L (Schein, C. H. 1997 Nature Biotechnol. 15: 529-536.) . Las RNasas pueden fusionarse con anticuerpos de proteína de membrana específicos para crear inmunotoxinas. Por ejemplo, la fusión de RNasa con anticuerpos para el receptor de transferrina o para el antígeno de linfocitos T CD5 conduce a la inhibición de la síntesis proteica en células tumorales que portan un receptor específico para cada una de las toxinas anteriores (Rybak, M. y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207; Newton DL, y col., 1998, Biochemistr y 14; 37 (15) : 517383) . Puesto que las RNasas son menos tóxicas para animales, estas pueden tener menos efectos secundarios indeseables que las inmunotoxinas usadas en la actualidad.

La citotoxicidad de las ribonucleasas citotóxicas parece estar relacionada inversamente con la fuerza de la interacción entre un inhibidor de ribonucleasa (RI) y la RNasa. El inhibidor de ribonucleasa (RI) es una molécula de 55 origen natural hallada dentro de células de las vértebras que sirve para proteger estas células de los efectos potencialmente letales de las ribonucleasas. El inhibidor de ribonucleasa es una proteína citosólica de 50 kDa que se une a RNasas con diversa afinidad. Por ejemplo, el RI se une a miembros de la superfamilia de la ribonucleasa pancreática bovina A (RNasa A) de ribonucleasas con constantes de inhibición que abarcan diez órdenes de magnitud, con Ki que varían de 10-6 a 10-16 M.

A-RNasas La ONCONASA, como RNasa A y BS-RNasa, es un miembro de la superfamilia de RNasa A. Los miembros de la superfamilia de RNasa A comparten aproximadamente el 30 % de identidad en secuencias de aminoácidos. La mayoría de los restos no conservados se localizan en bucles superficiales y parecen desempeñar un papel significativo en la actividad biológica dedicadaza de cada RNasa. La ONCONASA se aisló de oocitos y embriones tempranos de rana Leopardo (Rana pipiens) . Tiene efecto antitumoral en una diversidad de tumores sólidos, tanto in situ como in vivo (Mikulski S. M., y col., 1990 J. Natl. Cancer 17; 82 (2) : 151-3) . También se ha descubierto que la ONCONASA inhibe específicamente la replicación de VIH-1 en células de leucemia H9 infectadas a concentración no citotóxica (Youle R. J., y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 21; 91 (13) : 6012-6) .

Aunque la actividad RNasa de ONCONASA es relativamente baja, se acepta que las actividades enzimáticas y citotóxicas de la misma están asociadas en cierto grado. Se cree que la estructura terciaria de las A-RNasas diferencia entre tipos citotóxico y no citotóxico. Por ejemplo, se cree que las diferencias entre la estructura terciaria de onconasa y RNasa A son responsables de la citotoxicidad aumentada observada para ONCONASA. La ONCONASA, a diferencia de RNasa A, contiene un resto Glu 1 N terminal bloqueado (piroglutamato) es esencial para la actividades tanto enzimáticas como citotóxicas. Esta estructura única permite a la ONCONASA permear en células diana (Boix E., y col., 1996, J. Mol. Biol. 19: 257 (5) : 992-1007) . Además, en la ONCONASA el resto Lys9 reemplaza el resto Gln11 de RNasa A, que se cree que efectúa la estructura del sitio activo. Además, las diferencias en la secuencia de aminoácidos de la estructura primaria entre ONCONASA y RNasa A provocan cambios topológicos en la periferia del sitio activo que efectúan la especificidad del mismo (Mosimann S. C., y col., 1992, Proteins 14 (3) : 392-400) .

Las diferencias de citotoxicidad entre las A-RNasas también se atribuyen a su capacidad para unirse a RI. La ribonucleasa seminal bovina (BS-RNasa) es el 80 % idéntica en su secuencia de aminoácidos a RNasa A, pero a diferencia de otros miembros de la superfamilia de RNasa A, la BS-RNasa existe en forma dimérica. Se ha mostrado que la estructura cuaternaria de BS-RNasa evita la unión con RI, permitiendo de este modo que la enzima conserve su actividad ribonucleolítica en presencia de RI (Kim y col., 1995, J. Biol. Chem. 270 Nº 52: 31097-31102) . La... [Seguir leyendo]

1. Una ribonucleasa de la familia T2 para uso en la prevención, la inhibición y/o la inversión de la proliferación, la colonización, la diferenciación y/o el desarrollo de células tumorales en un sujeto en donde dicha ribonucleasa de la familia T2 es RNasa B1 y estando dicha ribonucleasa desprovista de actividad ribonucleolítica.

2. La ribonucleasa de la reivindicación 1 para el uso de la reivindicación 1, en donde las células tumorales son células asociadas con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en papiloma, blastoglioma, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Burkitt.

3. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o 2 para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde dichas células tumorales son células cancerosas.

4. Una ribonucleasa de la familia T2 para uso en la inhibición de la angiogénesis de un tumor en un sujeto, en donde la RNasa T2 se une a actina en su forma ribonucleolítica activa o no activa.

5. La ribonucleasa de la familia T2 de la reivindicación 4 para el uso de la reivindicación 4, en donde la proteína de ribonucleasa T2 tiene un peso molecular de entr.

2. 36 kDa.

6. La ribonucleasa de la reivindicación 4 o 5 para el uso de la reivindicación 4 o 5, en donde dicho tumor es un tumor metastásico.

7. La ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde dicho tumor está asociado con un trastorno o una enfermedad seleccionados del grupo que consiste en papiloma, blastoglioma, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Burkitt.

8. La ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde dicha ribonucleasa de la familia T2 se selecciona del grupo que consiste en RNasa T2, RNasa Rh, RNasa M, RNasa Trv, RNasa Irp, RNasa Le2, RNasa Phyb, RNasa LE, RNasa MC, RNasa CL1, RNasa Bsp1, RNasa RCL2, RNasa Dm, RNasa Oy y RNasa Tp.

9. La ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde dicha ribonucleasa de la familia T2 se selecciona del grupo que consiste en RNasa T2, RNasa Rh, RNasa M, RNasa Trv, RNasa Irp, RNasa Le2, RNasa Phyb, RNasa LE, RNasa MC, RNasa CL1, RNasa Bsp1, RNasa RCL2, RNasa Dm, RNasa Oy y RNasa Tp, RNasa HI0526, RNasa I, RNasa Irp1, RNS2, RNasa 3, RNasa 1, RNasa LX y RNasa 6PL.

10. La ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en donde dicho tumor es un tumor maligno.

11. La ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde dicha ribonucleasa es una ribonucleasa T2 de un organismo seleccionado del grupo que consiste en Aeromonas hydrophila, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Aspergillus or y zae, Aspergillus phoenicis, Rhisopus niveus, Trichoderma viride, Lentinula edodes, Irpex lacteus; Physarum polycephlum, Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Nicotiana alata, Malus domestica, Pyrus pyrifolia, Momordica charantia, Gallus gallus, Rana catesbeiana, Drosophyla melanogaster, Crassostera gigus, Todarodes pasificus y Homo sapiens.