Uso de la proteína 7F4 en el diagnóstico in vitro de infecciones por mycoplasma pneumoniae.

Uso del polipéptido con la secuencia de aminoácidos ID SEQ N.° 2 con el fin de detectar,

in vitro, enmuestras biológicas tomadas de un ser humano, la presencia de anticuerpos producidos después de una infecciónpor Mycoplasma pneumoniae.

Uso de la proteína 7F4 en el diagnóstico in vitro de infecciones por mycoplasma pneumoniae

La presente invención se refiere al uso de un polipéptido y de un polinucleótido en el campo del diagnóstico serológico de las infecciones por Mycoplasma pneumoniae.

Mycoplasma pneumoniae es una bacteria de crecimiento intracelular carente de pared y que invade las células epiteliales respiratorias. Es responsable de infecciones respiratorias agudas que se encuentran frecuentemente en los niños a partir de 5 años de edad y en adultos jóvenes. Estas infecciones pueden ser neumonías atípicas con evolución favorable, en ocasiones asociadas a otras manifestaciones ORL, cutáneas, hematológicas, neurológicas o, con más frecuencia, traqueobronquitis. Se estima que Mycoplasma pneumoniae es responsable de entre el 15 % y el 20 % de las neumopatías extrahospitalarias que se manifiestan en estado endémico con pequeños brotes epidémicos cada cuatro a siete años. (Bébéar C, Bébéar C.M et de Barbeyrac B. dans FreneyJ, Renaud F, Hansen W, Bollet C, Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000) .

Se observa un primer pico de incidencia en niños con edades comprendidas entre 5 a 15 años, en los cuales se cree que Mycoplasma pneumoniae sería responsable de casi el 40 % de los casos de neumonías extrahospitalarias, de los cuales casi el 20 % requiere hospitalización. El segundo pico de incidencia afecta a los adultos mayores de 50 años de edad, con cifras que aumentan gradualmente con la edad hasta superar el 30 % (Brunner H, Mycoplasma pneumoniae infections. Isr. J. Med Sci. (1981) , 17:516 – 523; Ghosh et al. Surveillance of Mycoplasma pneumoniae infections in Scotland 1986 – 1991. J Infect. (1992) , 25: 221 – 227; Waites et al. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. (2004) , 17: 697 – 728) . El considerable lapso entre la primoinfección en niños y la reinfección en adultos pone de manifiesto que la infección en el niño confiere a la persona una protección inmunitaria eficaz frente a la reinfección.

También se ha observado una asociación clínica entreM. pneumoniae y el asma infantil, si bien aún no se ha determinado claramente la naturaleza de la correlación. (Hansbro PM et al., Role of atypical bacterial infection of the lung in predisposition/protection of asthma. Pharmacology et Therapeutics (2004) , 101: 193 – 210) .

Parece que existe una subestimación frecuente de las infecciones tanto agudas como crónicas, por M. pneumoniae en niños, en patologías tales como el asma o las neumopatías extrahospitalarias.

Mycoplasma pneumoniae entra en el organismo por vía aérea (inhalación de gotas respiratorias (aerosoles) , contacto directo con personas infectadas) al adherirse a las células del epitelio respiratorio. Este contacto genera un estrés oxidativo que tiene como resultado la alteración del movimiento ciliar y la formación de lesiones celulares, que desembocan en una reacción inflamatoria local. La reacción inmunológica puede conducir a la aparición de infiltrados y, en ocasiones, incluso de autoanticuerpos. Algunos antígenos de membrana de M. pneumoniae son de hecho similares a los antígenos que se encuentran en el cerebro y el páncreas. (Waites KB, Talkington DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen, Clin Microbiol Rev., 2004) .

Muchos agentes infecciosos, sean virales o bacterianos, pueden estar en el origen de una neumonía y la sintomatología respiratoria apenas permite distinguir las infecciones por M. pneumoniae de las causadas por otros agentes de las neumonías atípicas. El inicio de la enfermedad es progresivo tras una incubación de entre 15 y 20 días. La enfermedad cursa con fiebre, malestar, cefaleas, mialgias y raquialgias y, sobre todo, una tos seca y persistente. El estado general aparece poco alterado y la exploración física muestra pocos síntomas, en contraste con la importancia de las imágenes radiológicas de los pulmones. Por lo general, la enfermedad es regresiva con el tiempo, si bien la convalecencia es larga y la tos es persistente. M. pneumoniae también puede causar diversas complicaciones extrapulmonares por dispersión a otros órganos: pleuresía, erupciones cutáneas, sinusitis, miocarditis, pericarditis, ataques articulares, anemia hemolítica, manifestaciones nerviosas, infecciones genitales. (Waites KB, Talkington DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen, Clin Microbiol Rev., 2004) .

El tratamiento de las infecciones por Mycoplasma pneumoniae se basa en una selección probabilística en función de la edad, especialmente en los niños, y en criterios clínicos y radiológicos, ninguno de los cuales resulta demasiado específico ni sensible.

La ausencia de pared hace que esta bacteria sea insensible a la penicilina y otras betalactaminas prescritas habitualmente en los casos de neumonía de origen bacteriano. En consecuencia, los antibióticos utilizados con frecuencia en las infecciones por M. pneumoniae son las tetraciclinas, las fluoroquinolonas, los macrólidos y compuestos relacionados. Sin embargo, ya se han observado casos de resistencia a las fluoroquinolonas y los macrólidos (Matsuoka, et al. Characterization and Molecular analysis of Macrolide-Resistant Mycoplasma pneumoniae clinical isolates obtained in Japan. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48, 12: 4624 – 4630; Gruson D. et al. In vitro developpement of resistance to six and four fluoroquinolones in Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma hominis respectively. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49, 3: 1190 – 1193) . Estos problemas de resistencia hacen que el diagnóstico de una infección por M. pneumoniae resulte fundamental para que el tratamiento con antibióticos sea apropiado y se administre precozmente.

En la actualidad, el diagnóstico directo se realiza mediante cultivo o reacción de polimerización en cadena (PCR) . Como procedimientos de diagnóstico indirecto, existen pruebas serológicas, tales como las aglutininas frías, la reacción de fijación del complemento, la inmunofluorescencia indirecta, la aglutinación pasiva y las pruebas de ELISA. Sin embargo, no existe una prueba diagnóstica de referencia para la detección de las infecciones por M. pneumoniae.

El cultivo de M. pneumoniae puede llevarse a cabo a partir de muestras de garganta, de aspiraciones nasofaríngeas en niños y de lavados broncoalveolares, pero lleva mucho tiempo (de 2 a 3 semanas) y es laborioso. Rara vez realizan de forma rutinaria, y tiende a quedar reservado a los laboratorios de referencia. Sin embargo, si el resultado es positivo, es 100 % específico. Debido a que la bacteria puede persistir durante hasta varias semanas después de la infección, es necesario realizar pruebas complementarias, tales como la prueba de anticuerpos específicos, con el fin de confirmar el diagnóstico de una infección activa.

La amplificación génica por PCR, a partir de muestras procedentes de las vías respiratorias, es un procedimiento más rápido y más sensible que el cultivo (de 100 muestras positivas por PCR, solamente 60 son positivas por cultivo) . Se han propuesto diversos sistemas, tales como la amplificación de secuencias al azar, la amplificación del gen de la adhesina o incluso del gen que codifica para el ARN 16S. Esta estrategia es sensible (entre el 78 % y el 92 %) , y permite la detección de 10 a 100 ufc con buena especificidad (entre el 92 % y el 100 %) Mycoplasma pneumoniae respirator y tract infections, J. Clin. Microbiol., 2003) . No obstante, no existen kits de detección disponibles comercialmente y, por lo tanto, la técnica no está normalizada y resulta muy costosa y demasiado compleja como para utilizarla de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios de microbiología clínica.

Las serologías son los procedimientos utilizados con mayor frecuencia en el diagnóstico de la infección por

M. pneumoniae, especialmente cuando no se disponga de muestras. Tras una infección por M. pneumoniae, el sistema inmunitario de un individuo no inmunodeprimido responde rápidamente con la producción de anticuerpos, los cuales alcanzan su máxima concentración tras entre 3 y 6 semanas, y posteriormente descienden gradualmente durante un período que va desde varios meses hasta varios años. La producción de inmunoglobulinas M (IgM) , específicas para M. pneumoniae, se produce entre 7 y 10 días después del inicio de la infección. Así, con frecuencia, su detección es la prueba de una infección reciente, especialmente en niños... [Seguir leyendo]

1. Uso del polipéptido con la secuencia de aminoácidos ID SEQ N.° 2 con el fin de detectar, in vitro, en muestras biológicas tomadas de un ser humano, la presencia de anticuerpos producidos después de una infección por Mycoplasma pneumoniae.

2. Uso con el fin de detectar, in vitro, en muestras biológicas tomadas de un ser humano, la presencia de anticuerpos producidos después de una infección por Mycoplasma pneumoniae, de un polipéptido que comprende:

a) un fragmento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido identificado en la reivindicación 1 y que presenta la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 2, o bien b) una secuencia de aminoácidos que presenta una similitud de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos del polipéptido identificado en la reivindicación 1 o con un fragmento de la secuencia identificada en a) , y que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 2, teniendo en cuenta que:

por «fragmento de la secuencia de aminoácidos» se entiende un polipéptido que comprende por lo menos «n» aminoácidos consecutivos procedentes del polipéptido ID SEQ N.° 2, en el que, en función de las secuencias, n será igual a 7 aminoácidos o más, y por «que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 2» se entiende una función de antígeno de Mycoplasma pneumoniae.

3. Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el polipéptido se prepara cultivando una célula huésped que comprende un vector recombinante que posee, insertado en él, un polinucleótido que codifica para el citado polipéptido y aislando el citado polipéptido del medio de cultivo.

4. Uso según la reivindicación 3, cuando esta es dependiente de la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido presenta la secuencia ID SEQ N.° 1.

5. Uso de un polinucleótido con la secuencia ID SEQ N.° 1 con el fin de detectar, in vitro, en muestras biológicas tomadas de un ser humano, la presencia de anticuerpos producidos después de una infección por Mycoplasma pneumoniae.

6. Uso con el fin de detectar, in vitro, en muestras biológicas tomadas de un ser humano, la presencia de anticuerpos producidos después de una infección por Mycoplasma pneumoniae, de un polinucleótido que comprende:

a) un fragmento de la secuencia del polinucleótido identificado en la reivindicación 5 y que presenta la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 1, o bien b) una secuencia polinucleotídica que presenta una similitud de al menos el 60 % con la secuencia del polinucleótido identificado en la reivindicación 5 o con un fragmento de la secuencia identificada en a) , y que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 1, o bien c) una secuencia polinucleotídica complementaria a una de las secuencias polinucleotídicas identificadas en la reivindicación 5 o en los puntos a) o b) anteriores, teniendo en cuenta que:

por «fragmento de la secuencia del polinucleótido» se entiende un polinucleótido que comprende por lo menos «n» nucleótidos consecutivos procedentes del polinucleótido ID SEQ N.° 1, en el que, en función de las secuencias, n será igual a 21 nucleótidos o más, y por «que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 1» se entiende una función de codificación de un polipéptido antígeno de Mycoplasma pneumoniae.

7. Una vacuna para la prevención de infecciones causadas por Mycoplasma pneumoniae en seres humanos, que comprende, como principio activo, al menos:

a) un polipéptido con la secuencia de aminoácidos ID SEQ N.° 2, o bien b) un polipéptido cuya secuencia es un fragmento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido identificado en a) y que presenta la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 2, o bien c) un polipéptido cuya secuencia es una secuencia de aminoácidos que presenta una similitud de al menos el 60 % con la secuencia de aminoácidos del polipéptido identificada en a) o con el fragmento de la secuencia identificada en b) , y que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 2, además de un excipiente farmacéuticamente aceptable, teniendo en cuenta que:

por «fragmento de la secuencia de aminoácidos» se entiende un polipéptido que comprende por lo menos «n» aminoácidos consecutivos procedentes del polipéptido ID SEQ N.° 2, en el que, en función de las secuencias, n será igual a 7 aminoácidos o más, y por «que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 2» se entiende una función de antígeno de Mycoplasma pneumoniae.

8. Una vacuna para la prevención de infecciones causadas por Mycoplasma pneumoniae en seres 5 humanos, que comprende, como principio activo, al menos:

a) un polinucleótido con la secuencia ID SEQ N.° 1, o bien b) un polinucleótido cuya secuencia es un fragmento de la secuencia del polinucleótido identificado en a) y que presenta la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 1, o bien

c) un polinucleótido cuya secuencia es una secuencia polinucleotídica que presenta una similitud de al menos el 60 % con la secuencia del polinucleótido identificado en a) o con un fragmento de la secuencia identificada en b) , y que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 1, o bien d) un polinucleótido cuya secuencia es una secuencia polinucleotídica complementaria a una de las secuencias polinucleotídicas identificadas en a) , b) o c) , además de un excipiente farmacéuticamente

aceptable, teniendo en cuenta que:

por «fragmento de la secuencia del polinucleótido» se entiende un polinucleótido que comprende por lo menos «n» nucleótidos consecutivos procedentes del polinucleótido ID SEQ N.° 1, en el que, en función de las secuencias, n será igual a 21 nucleótidos o más, y

por «que posee la misma función que la citada secuencia ID SEQ N.° 1» se entiende una función de codificación de un polipéptido antígeno de Mycoplasma pneumoniae.