Uso de precursores de encefalinas y/o sus fragmentos en diagnosis médica.

Método in vitro para la determinación de fragmentos de proencefalina en plasma con fines diagnósticos,

endonde se determinan fragmentos de proencefalina que comprenden (i) los aminoácidos de ENK-fp que constande aminoácidos 119 a 159 de la secuencia de aminoácidos completa de proencefalina según la ID SEC Nº: 1 y(ii) aminoácidos adicionales de la secuencia de proencefalina ID SEC Nº: 1 que comprende secuencias deaminoácidos ID SEC Nº: 4 y/o ID SEC Nº: 5, mediante un método inmunodiagnóstico que usa un primeranticuerpo que se une específicamente a dicho fragmento ENK-fp de proencefalina, uniéndose específicamentedicho primer anticuerpo al péptido según la ID SEC Nº: 3, en combinación con un segundo anticuerpo que seune a una de las secuencias de aminoácidos según la ID SEC Nº: 4 ó la ID SEC Nº: 5.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10011674.

Solicitante: B.R.A.H.M.S GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: NEUENDORFSTRASSE 25 16761 HENNIGSDORF ALEMANIA.

Inventor/es: BERGMANN, ANDREAS, SPARWASSER,ANDREA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/26 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra hormonas.
  • G01N33/94 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen narcóticos.

PDF original: ES-2431288_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Uso de precursores de encefalinas y/o sus fragmentos en diagnosis médica [0001] La presente memoria descriptiva se refiere al uso de proencefalina y/o sus fragmentos, fragmentos que comprenden proencefalina y/o combinaciones de los mismos en diagnosis médica. En el siguiente texto, a todas estas moléculas, fragmentos, combinaciones de los mismos, etcétera, se les hace referencia como proencefalina, que comprende por ejemplo, también el péptido B y F, huella de encefalina (ENK-fp) , proencefalina A y la secuencia de aminoácidos ID 1.

La proencefalina se puede usar para diagnosticar una variedad de enfermedades, que comprenden enfermedades/trastornos del sistema nervioso central, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, isquemia, comprendiendo isquemia del miocardio, esquizofrenia, enfermedades/trastornos del sistema inmunitario; enfermedades/condiciones de dolor, dolor crónico, migraña, cefalea de tipo tensional, enfermedades tumorales/cáncer comprendiendo leucemia linfoblástica, tumores cerebrales malignos, adenomas, en particular adenomas de pituitaria humana, trastornos de la barrera hematoencefálica, esclerosis múltiple, inflamación, artritis crónica, enfermedades infecciosas, infecciones bacterianas y virales, en particular infecciones de bacterias gram-positivas, infecciones por virus de la enfermedad de borna, peritonitis, intoxicación, SIDA, estrés, trauma, que comprende trauma en la cabeza, infarto, en particular infarto cerebral, enfermedades cardiacas y cardiovasculares, que comprenden cardiopatía coronaria, trastornos óseos y de la piel, malaria, enfermedad pulmonar obstructiva/crónica y daño cerebral.

El término proencefalina de la presente memoria descriptiva comprende también secuencias de aminoácidos que presentan una homología de por lo menos el 75%, preferentemente una homología de por lo menos el 80%, más preferentemente una homología de por lo menos el 90% con la proencefalina.

La memoria descriptiva se refiere además a anticuerpos desarrollados contra proencefalina y/o sus fragmentos y/o sus variantes de corte y empalme (splice) , precursores y kits y ensayos que involucran dichos componentes.

Antecedentes de la invención [0005] El gen de la proencefalina A humana (PENK-A) contiene 4 exones y codifica una serie de oligopéptidos estructuralmente relacionados tales como metionina-encefalina (Met-ENK) , leucina-encefalina (Leu-ENK) y metioninaencefalina-arginina-fenilalanina (Met-ENK-Arg-Phe) , así como metionina-encefalina-arginina-glicina-leucina (Met-ENK-Arg-Gly-Leu) , en donde una molécula de proencefalina comprende las secuencias de 4 Met-ENK y una Leu-ENK, una Met-ENK-Arg-Phe y una Met-ENK-Arg-Gly-Leu cada una de ellas. La Met-ENK-Arg-Phe y la Met-ENK-Arg-Gly-Leu son adicionalmente metabolizadas a Met-ENK. Las encefalinas tienen una función como neurotransmisores, así como neuromoduladores y neurohormonas. La PENK-A además de las encefalinas comprende las secuencias de encelitina y péptido B en su terminal N, así como sinencefalina en su terminal C, que tienen una función antibacteriana.

La expresión de proencefalina se produce en el sistema nervioso central, así como en el sistema nervioso periférico. En el cerebro se observan concentraciones incrementadas de PENK en el núcleo caudado y en el núcleo accumbens, en la sustancia gris periacueductal así como en el hipocampo y los núcleos del rafe.

Las encefalinas desempeñan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos tales como la percepción del dolor, la regulación de la respuesta al estrés, comprendiendo la regulación hormonal, la regulación de la formación de hueso, así como la regulación de respuestas inmunes. La Met-ENK estimula la proliferación de linfocitos B y T, y la Leu-ENK la proliferación de células T auxiliares y células T citotóxicas. Debido a las propiedades inmunorregulatorias de la Met-ENK, esta encefalina está clasificada como citoquina. Los péptidos de las encefalinas endógenas están también implicados en la regulación normal de funciones cardiovasculares tales como la frecuencia cardíaca, la fuerza de contracción y la presión sanguínea arterial.

La encelitina tiene función antibacteriana contra bacterias gram-positivas tales como las Streptococcus aureus, Bacillus megaterium y Micrococcus luteus, si bien no inhibe el crecimiento de bacterias gram-negativas tales como la Escherichia coli, así como el crecimiento de hongos. La sinencefalina presenta propiedades antibacterianas contra bacterias gram-positivas así como bacterias gram-negativas.

El nivel de encefalina se encuentra alterado en tejido y fluidos corporales en una variedad de enfermedades. La reactividad inmune de Met-ENK en plasma de pacientes que padecen de un infarto cerebral en fase aguda y de pacientes con diabetes con isquemia del miocardio sintomática está significativamente incrementada en comparación con individuos de control sanos, así como en plasma y fluido (liquor) de pacientes que padecen de migraña y cefalea y en fluido de pacientes con esquizofrenia.

En la enfermedad de Parkinson el contenido de Met-ENK-Arg-Gly-Leu en fluido de pacientes está significativamente reducido en comparación con individuos de control sanos.

Pacientes que padecían de la enfermedad de Alzheimer presentaban una reactividad inmune de tipo Met-ENK 4 veces mayor.

La concentración de RNAm de encefalina en el cuerpo estriado de pacientes que padecen de la enfermedad de Huntington está significativamente reducida, y en fluido se observaba una disminución de la concentración de Met-ENK-Arg-Gly-Leu.

En enfermedades tumorales los adenomas secretores de prolactina (PL) y de adrenocorticotropina (ACTH) de la hipófisis presentan una concentración incrementada de Met-ENK, así como una concentración de péptidos de proencefalina 10 veces mayor en ésta última.

Las encefalinas desempeñan un papel en la respuesta patofisiológica de tejido nervioso en lesiones traumáticas tales como lesiones de la cabeza y lesiones de la piel, por ejemplo durante cirugía y después de la misma.

Las encefalinas desempeñan además un papel importante en la patogénesis de inflamaciones sistémicas. En modelos animales la inducción de una peritonitis o la aplicación de lipopolisacáridos conducen a un incremento de la expresión de PENK, así como a un incremento de las concentraciones de Met-ENK en plasma. En abscesos de ganado bovino periartrítico pudieron detectarse distintos fragmentos de PENK que comprenden la secuencia de encelitina. En monocitos periféricos humanos y en linfocitos de rata pudo demostrarse la inducción de expresión de RNAm de PENK por lipopolisacáridos.

La infección de ratas por borna-virus redundó en una transcripción incrementada de PENK-A en el cuerpo estriado.

La Met-ENK, la Met-ENK-Arg-Phe y los péptidos B y F de proencefalina están significativamente incrementados en plasma durante la hipotensión hemorrágica.

La biosíntesis de encefalinas (véase la Fig. 2) se produce, como en el caso de otras hormonas peptídicas, como preprohormona en ribosomas unidos (al Golgi) . Tras la separación de la secuencia señal N-terminal hidrófoba por las denominadas peptidasas señal y el plegamiento de las proteínas en el lumen del retículo endoplasmático, los propéptidos son empaquetados en vesículas en el aparato de Golgi y son transportados a la membrana celular. Durante el transporte los propéptidos son procesados siendo así convertidos en hormonas maduras por las denominadas prohormona convertasas en secuencias de aminoácidos habitualmente dibásicos. Por medio de distintos estímulos los péptidos son secretados al espacio extracelular o al plasma. Los péptidos maduros son rápidamente inactivados tras la secreción por proteólisis.

Las encefalinas tienen una vida media de 12 a 15 minutos en plasma (ex vivo) .

El procesado de la proencefalina se produce en varios pasos en un estricto orden en el tiempo y es histoespecífico. Un paso inicial en el procesado es la separación del péptido B C-terminal que comprende las secuencias de encelitina y Met-ENK-Arg-Phe. El procesado de la proencefalina conduce a la formación de distintos péptidos de proencefalina. La presencia del fragmento 119-159 de PENK en fluido, aunque no en sangre, ya fue revelada por Stark et al., 2000.

En la medida en la que este fragmento desempeña un papel importante en esta invención, se le denomina en la presente “huella de encefalina” (ENK-fp) .

Böttger et al. (1995) , JMB, Vol. 247, págs. 932 a 946 dan a conocer un análisis de epítopos de proencefalina usando anticuerpos monoclonales. No se da a conocer ningún... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método in vitro para la determinación de fragmentos de proencefalina en plasma con fines diagnósticos, en donde se determinan fragmentos de proencefalina que comprenden (i) los aminoácidos de ENK-fp que constan 5 de aminoácidos 119 a 159 de la secuencia de aminoácidos completa de proencefalina según la ID SEC Nº: 1 y

(ii) aminoácidos adicionales de la secuencia de proencefalina ID SEC Nº: 1 que comprende secuencias de aminoácidos ID SEC Nº: 4 y/o ID SEC Nº: 5, mediante un método inmunodiagnóstico que usa un primer anticuerpo que se une específicamente a dicho fragmento ENK-fp de proencefalina, uniéndose específicamente dicho primer anticuerpo al péptido según la ID SEC Nº: 3, en combinación con un segundo anticuerpo que se une a una de las secuencias de aminoácidos según la ID SEC Nº: 4 ó la ID SEC Nº: 5.

2. Método según la reivindicación 1, en donde dicha determinación se efectúa en plasma para el diagnóstico de sepsis y enfermedad de Alzheimer.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde por lo menos un anticuerpo se etiqueta con un marcador detectable.

4. Método según la reivindicación 3, en donde dicho marcador es un marcador luminiscente.

5. Kit para llevar a cabo un método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende dos anticuerpos que se unen a los fragmentos de proencefalina a determinar, en donde el primero de dichos anticuerpos se une específicamente al péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 3, y el segundo de dichos anticuerpos se une específicamente a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 4 ó la ID SEC Nº: 5.


 

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