Uso de inhibidores de la actividad de la proteína Filamina A para la elaboración de composiciones farmacéuticas,

compuestos inhibidores de dicha actividad, composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones terapéuticas y procedimiento de identificación de dichos compuestos inhibidores.

La presente invención describe por primera vez la actividad inductora de la infección del VIH-1 de la proteína Filamina A (FLNa) como regulador de las interacciones de la proteína CD4 y de los coreceptores CXCR4 y CCR5, convirtiéndose de esta forma en una diana terapéutica. Además, se han identificado los dominios de estas proteínas reguladores de dichas interacciones identificándose moléculas inhibidoras de las mismas que pueden ser utilizadas para la elaboración de composiciones terapéuticas útiles para el tratamiento y prevención de la infección por VIH-1, entre otras enfermedades. Finalmente, la FLNa puede convertirse en la base de un procedimiento de identificación de nuevos compuestos inhibidoresde la infección por VIH-1

Uso de inhibidores de la actividad de la proteína Filamina A para la elaboración de composiciones farmacéuticas, compuestos inhibidores de dicha actividad, composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones terapéuticas y procedimiento de identificación de dichos compuestos inhibidores.

Campo de la técnica

La presente invención se enmarca en el desarrollo de nuevas composiciones farmacéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades provocadas por el virus VIH-1 o que cursen con una estimulación alterada del sistema inmune. Por lo tanto, debe adscribirse al sector farmacológico y biomédico de las enfermedades virales.

Estado de la técnica

El VIH-1 se disemina por la interacción del virus con una célula diana, o mediante la transmisión directa entre una célula infectada con una célula sana. En ambas situaciones, la infección de las células dianas por VIH-1 requiere que la proteína de la envuelta (Env) gp120 induzca el agrupamiento de numerosas moléculas de CD4 y de co-receptor en la superficie celular. Esto permite la activación de la glicoproteína transmembrana gp41 de la envuelta viral, y la formación de un complejo que fusiona las membranas que contienen Env con la membrana de la célula diana (1). Estas interacciones dependen en gran medida de la concentración y distribución de los receptores celulares, y del contenido de colesterol de la membrana (2-9). Estudios cinéticos han demostrado que el agrupamiento de los receptores virales en la superficie de la célula diana no ocurre por difusión pasiva, sino que necesitan ser transportados activamente a la zona de contacto Env/receptor por el citoesqueleto de actina (10, 11). De hecho, el tratamiento de la célula diana con inhibidores de la remodelación de F-actina o con inhibidores de la proteína miosina, reduce la fusión mediada por Env y/o el agrupamiento de receptores (7, 10, 12).

Aunque se conocen los elementos básicos implicados en las etapas iniciales de la infección, los eventos moleculares que subyacen a la formación del complejo de fusión viral no están esclarecidos (13). Por ejemplo, están poco definidos los mecanismos por los cuales el VIH estimula la remodelación del citoesqueleto de la célula huésped durante la infección; las evidencias obtenidas son débiles y ocasionalmente contradictorias. Existe un fuerte debate sobre la importancia relativa de las interacciones necesarias para el agrupamiento de los receptores virales. Se ha sugerido que la acumulación de F-actina en la zona de contacto entre la célula diana y el virus o la célula infectada requiere las señales mediadas por Env-CD4 y Env-co-receptor (10); no obstante, el entrecruzamiento de CD4 puede ser suficiente para promover el agrupamiento de los receptores de quimioquinas, F-actina, el colesterol y otros componentes de las balsas lipídicas en células T (11). Más importante, se desconocen las vías de señalización específicas que conducen a la remodelación de F-actina tras la unión del VIH a los receptores, si bien se sabe que ni la señalización de CD4 vía p56Lck ni el acoplamiento de los co-receptores a las proteínas G heterotriméricas son necesarias para la infección (14-16). La identidad de las Rho GTPasas activadas por los receptores virales también es un tema de conflicto; un estudio ha asociado Rac (pero no RhoA) con la fusión mediada por Env (17), mientras que otro ha implicado a RhoA (pero no Rac) en dicho proceso (18). Finalmente, aunque CD4 y los co-receptores co-localizan en estructuras ricas en ezrina y talina (19), no se ha demostrado la interacción directa de los receptores virales con estas proteínas de unión a actina, ni tampoco se ha probado las consecuencias de dichas hipotéticas interacciones en la reorganización de F-actina o la infección por el VIH-1.

Una posibilidad es que CD4 y/o los co-receptores se encuentren unidos a una proteína adaptadora que conecte dichos receptores al citoesqueleto de actina y que, al mismo tiempo, organice la señalización requerida para la reorganización de F-actina; dicho "partner" molecular no se ha descrito hasta la fecha. Las proteínas de unión a actina de la familia de las filaminas pueden llevar a cabo dicha función. Un miembro de esta familia, filamina A (FLNa), está presente en la periferia del citoplasma. FLNa entrecruza filamentos de actina en redes ortogonales y ancla dichas redes a la membrana celular y a los intermediarios de señalización (20). FLNa consiste en dos subunidades de masa molecular relativa 280.000, cada una de las cuales contiene 24 repeticiones en tandem de aproximadamente 96 aminoácidos con estructura de hoja semejante a las inmunoglobulinas. El dominio de unión a actina de FLNa está en el N-terminal, mientras que el dominio de dimerización se localiza en la repetición 24 en el C-terminal (21). Ambos dominios son esenciales para la ramificación de los filamentos de actina. FLNa interacciona con un número de receptores de membrana y proteínas de transducción de señales intracelulares, lo que sugiere su función como adaptadores de señalización conectando y coordinando procesos celulares con la regulación dinámica del citoesqueleto de actina (22). La familia de las Rho GTPasas (23) y algunos de sus co- factores reguladores se ensamblan con FLNa que, a su vez, regula la actividad GTPasa, permitiendo a FLNa participar en la remodelación espacio-temporal de F-actina.

Una aproximación terapéutica sería el uso de compuestos que interaccionan con los receptores del VIH-1, capaces de regular los eventos tempranos en la reorganización de F-actina inducidos por la unión del virus a la célula huésped.

Las etapas iniciales de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) requieren el agrupamiento de numerosas moléculas del receptor CD4 y de los co-receptores CXCR4 y CCR5, en un proceso mediado por la glicoproteína viral gp120 y el citoesqueleto de actina. Los mecanismos por los cuales el VIH-1 induce la reorganización de F-actina (actina filamentosa) en la célula diana son desconocidos.

Aunque ha sido descrita la co-localización de CD4 y de los co-receptores del VIH-1 en estructuras ricas en ezrina y talina (19), la interacción directa entre estas proteínas de unión a actina y los receptores no ha sido establecida.

Descripción de la patente

Un objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína FLNa (en adelante, FLNa), en adelante uso de un compuesto inhibidor de la presente invención, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento de la infección por VIH-1 y de enfermedades que cursen con una estimulación alterada del sistema inmune.

Un objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de la actividad de la FLNa basado en el uso de una secuencia de nucleótidos como compuesto inhibidor, en adelante secuencia de nucleótidos FLNa de la presente invención, que permite la expresión de una proteína o péptido en células humanas, y que está constituido por una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente grupo:

Otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de la actividad de la FLNa basado en el uso de una secuencia de nucleótidos FLNa derivada de CD4 como compuesto inhibidor que está constituido por una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente grupo:

1. Uso de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína FLNa humana caracterizado por:

a) la secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante del dominio 10-12 de la proteína FLNa humana (FLNa^D10-12), comprendida por la SEQ ID NO3,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia de a),

c) secuencia de nucleótidos que difieren de la a), debido a la degeneración del código genético

o cualquiera de sus combinaciones, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de la infección por VIH-1 y de enfermedades que cursen con una estimulación alterada del sistema inmune.

2. Uso de un compuesto inhibidor que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína FLNa humana caracterizado por contener al menos un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína FLNa, caracterizados por las secuencias que se especifican a continuación: SEQ ID NO19, SEQ ID NO20; SEQ ID NO21, SEQ ID NO22, SEQ ID NO23, SEQ ID NO24; SEQ ID NO25 y SEQ ID NO26.

3. Uso de un compuesto inhibidor de la proteína FLNa humana caracterizado por:

a) la secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos del dominio 10-12 de la proteína FLNa humana (FLNa^D10-12) (SEQ ID NO4),

b) secuencias de aminoácidos con una identidad de al menos un 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con la secuencia SEQ ID NO4.

4. Secuencia de nucleótidos FLNa/dominio caracterizada porque su expresión permite la inhibición de la actividad de FLNa y porque pertenece al siguiente grupo:

a) la secuencia de nucleótidos FLNa constituida por el dominio 10-12 de FLNa, (FLNa^D10-12) de SEQ ID NO3,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia de a),

c) secuencia de nucleótidos que difieren de la a) debido a la degeneración del código genético.

5. Secuencia de aminoácidos FLNa/dominio caracterizada porque inhibe la actividad FLNa y porque pertenece al siguiente grupo:

a) la secuencia de aminoácidos constituida por el dominio 10-12 de FLNa, (FLNa^D10-12) de SEQ ID NO4,

b) secuencias de aminoácidos con una identidad de al menos un 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con las siguientes secuencias: SEQ ID NO4,

6. Vector de expresión génica caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos FLNa/dominio según la reivindicación 4.

7. Célula, ya sea procariota o eucariota, transformada o transfectada caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos FLNa/dominio según la reivindicación 4 o el vector de expresión FLNa/dominio según la reivindicación 6.

8. Uso de la célula según la reivindicación 7 para la fabricación de una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 5.

9. Uso de la célula eucariota según la reivindicación 7 para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica de terapia génica para el tratamiento y prevención de la infección por VIH-1 y de enfermedades que cursen con una estimulación alterada del sistema inmune.

10. Composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento de la infección del VIH-1 y de enfermedades que cursen con una estimulación alterada del sistema inmune caracterizada porque comprende uno o varios compuestos inhibidores según las reivindicaciones 1 a la 5, en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10 caracterizada porque el compuesto inhibidor está constituido por una o varias secuencias pertenecientes al siguiente grupo:

o cualquiera de sus combinaciones.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 10 donde el compuesto inhibidor es una secuencia de nucleótidos que impiden o disminuyen la expresión del gen codificante de la proteína FLNa humana caracterizado por contener al menos un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína FLNa, caracterizados por las secuencias que se especifican a continuación: SEQ ID NO19, SEQ ID NO20; SEQ ID NO21, SEQ ID NO22, SEQ ID NO23, SEQ ID NO24; SEQ ID NO25 y SEQ ID NO26.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 10 caracterizada porque el compuesto inhibidor es un vector de expresión según la reivindicación 6.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 10 donde el compuesto inhibidor contiene uno de los siguientes elementos:

15. Uso de la composición farmacéutica según las reivindicaciones 10 a la 14 en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una infección de VIH-1 o por enfermedades que cursan con una estimulación alterada del sistema inmune consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada.

16. Uso según la reivindicación 15 caracterizado porque la enfermedad que cursa con una estimulación alterada del sistema inmune pertenece al siguiente grupo:

17. Procedimiento de identificación de compuestos inhibidores de la actividad FLNa caracterizado porque se basa en la interacción de varias proteínas con la proteína FLNa y porque comprende los siguientes pasos:

18. Procedimiento de identificación según la reivindicación 17 caracterizado porque la interacción de las proteínas mencionadas, o fragmentos de las mismas, se analiza mediante un ensayo de dos híbridos, preferentemente en levaduras, de inmunoprecipitación entre las proteínas o analizando actividades biológicas específicas de CD4, CXCR4 y CCR5.

19. Procedimiento de identificación según la reivindicación 17 caracterizado porque la interacción FLNa-CD4 se analiza in vivo mediante inmunoprecipitación cruzada entre ambas proteínas; o mediante la activación de CD4 inducida por anticuerpos anti-CD4 y analizando posteriormente la fosforilación de FLNa en residuos de serina, o mediante la localización y determinación del tamaño del agrupamiento de CD4 en la membrana.

20. Procedimiento de identificación según la reivindicación 17 caracterizado porque la interacción FLNa-CXCR4 se analiza en ensayos de estimulación con su ligando, CXCL12, en células que expresan de forma estable un receptor CXCR4 marcado, por ejemplo con GFP; o analizando su acción sobre los flujos de Ca² o sobre la formación de F-actina o su actividad quimiotáxica.

21. Procedimiento de identificación según la reivindicación 17 caracterizado porque se analiza el papel de la proteína FLNa humana en la formación de la sinapsis del VIH-1 mediante la formación de conjugados entre células efectoras que expresan la proteína de la envuelta viral, por ejemplo env_IIIB, y células diana que expresan CD4 y/o CXCR4 marcados, por ejemplo con GFP, y donde se analiza la acumulación de CXCR4 en la zona de contacto entre la célula diana y efectora, así como la acumulación de FLNa y actina en el sitio de contacto.