Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador de tejido nervioso.

Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador detejido nervioso. La invención consiste en proporcionar el uso del LGF en la fabricación de medicamentos útiles en la regeneracióntisular pleiotrópica de uno o más tejidos lesionados

, en el queal menos uno de los tejidos lesionados forma parte del Sistema Nervioso Central y el medicamento está diseñado para ser administrado por vía sistémica. Se basa en el hecho de que la administración de LGF por vía intraperitoneal es capaz de promover un efecto positivo sobre un modelo de la enfermedad de Parkinson cuando se administra por vía intraperitoneal. Por ello, es una realización preferida de la invención aquélla en la que el medicamento se destina al tratamiento de la enfermedad de Parkinson, particularmentecuando el medicamento se destina a seres humanos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/ES2009/070106.

Solicitante: Díaz Gil, Juan José.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: DIAZ GIL, JUAN JOSE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/18 (Factores de crecimiento; Reguladores de crecimiento)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Medicamentos para el tratamiento de trastornos en... > A61P9/10 (para enfermedades isquémicas o ateroscleróticas; p.ej. medicamentos antianginosos, vasodilatadores coronarios,medicamentos para el tratamiento del infarto de miocardio, de la retinopatía, de la insuficiencia cerebrovascular, de la arterioesclerosis renal)
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Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador de tejido nervioso.

Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) como regenerador de tejido nervioso Campo técnico

La invención se refiere a la aportación del uso del factor de crecimiento de hígado (LGF) para la fabricación de un medicamento de administración sistémica en mamíferos para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, cuyo tratamiento requiere regeneración tisular. Dicha invención supone una mejora de la invención expuesta en la solicitud de patente ES200601018 y en la solicitud de patente internacional PCT/ES2007/070080, en la que se reivindicaba la prioridad de la anterior.

Técnica anterior

El Factor de crecimiento de hígado (LGF, del inglés liver growth factor), descubierto hace ya algunos años (Díaz Gil y cols., 1986), es una molécula purificada de suero de ratas después de hepatectomía parcial del 70%, o bien en ratas con ligadura del conducto biliar que, inyectado a ratas o ratones, tiene actividad "in vivo" como factor de crecimiento, incrementando la síntesis de ADN de hígado, el peso seco de hígado, el número de células "PCNA- positivas" (PCNA: antígeno nuclear de proliferación celular), produciendo una hiperplasia transitoria sin que se detecten efectos agresivos, ni inmediatos ni permanentes: sin producción de fibrosis, amiloides, ni perturbaciones mitocondriales ni nucleares (Díaz Gil y cols., 1994).

Su estructura química fue definida por los mismos autores como un complejo albúmina-bilirrubina, después de un estudio de espectros de absorción, fluorescencia, dicroísmo circular, mapas trípticos, composición de aminoácidos, movilidad electroforética, inmunofluorescencia, formación de complejos albúmina-bilirrubina "in vitro", estudio de la actividad biológica tanto "in vivo" como in vitro" e identificación por HPLC (Díaz Gil y cols., 1987; Díaz Gil y cols., 1988).

El LGF tiene asimismo actividad "in vitro", en cultivo primario de hepatocitos de rata, incrementando la síntesis de ADN, el número de células, la actividad del sistema A de transporte de membrana y otros (Díaz Gil y cols., 1986). El LGF se ha purificado igualmente de suero de humanos con hepatitis tipo B, con estructura y características casi idénticas que el de ratas (Díaz Gil y cols., 1989). Otros autores (Abakumova y cols., 1994) han corroborado la actividad de complejos albúmina-bilirrubina como factores de crecimiento de hígado.

Igualmente, se ha demostrado la capacidad del LGF para estimular la regeneración del hígado dañado por la acción de diversas hepatotoxinas (Díaz Gil y cols., 1994b; Díaz Gil y cols., 1999). En un modelo de cirrosis inducida por CCl4, una vez llegado a una situación irreversible, la inyección del LGF fue capaz de disminuir la fibrosis, produciendo una reestructuración sustancial del parénquima hepático, mejora de inflamación y necrosis, aumento de funcionalidad hepática y recuperación de diversas funciones hemodinámicas, como: presión portal, presión arterial, shunting portosistémico y resistencia vascular sistémica, así como reducción de la ascitis. Sin embargo, el complejísimo entramado que da lugar al establecimiento de fibrosis en los distintos tipos de órganos, aun teniendo diversas pautas en común, presenta tantas particularidades dependiendo del órgano de que se trate, que la acción antifibrótica del LGF en hígado no aseguraba que pudiera presentar la misma capacidad en algún otro órgano diferente.

Por otro lado, y en investigaciones realizadas por diversos grupos principalmente en células endoteliales, se han identificado tres tipos de receptores de albúmina en la membrana celular, las tres glicoproteínas: una gp60, con función principalmente de transcitosis, que se encargaría principalmente de pasar la albúmina de un lado a otro de las células endoteliales (Ghinea y cols., 1988), y dos con función de endocitosis, para introducir la albúmina al interior de la célula, gp18 y gp31. Estos últimos receptores ligan preferentemente las albúminas en las que se ha variado su conformación por "binding" a un ligando. La afinidad es 1000 veces comparada con la que se observa con albúmina nativa (Schnitzer y cols., 1992). Las gp18 y gp31 se expresan preferentemente en células endoteliales de tejidos fetales, recién nacidos o adultos, registrándose mayor concentración en los órganos de proliferación muy activa o en las fases de mayor crecimiento, en cerebro, pulmón, timo, corazón, músculo esquelético, hígado, médula espinal, bazo, páncreas, testículo, adenohipófisis, placenta, endometrio, miometrio y leucocitos (Morioanu y cols., 1990).

La hipótesis que utilizaron estos autores para explicar el porqué de la universalidad y abundancia de estos receptores gp18 y gp31 en casi todo tipo de órganos, fue que o bien sirven: 1) para metabolizar "albúminas modificadas" (albúmina que lleva ligados algunos otros compuestos, como anhídrido maleico, formaldehído u otros, y que cambia su conformación), que se sabe que existen en suero de humanos en concentraciones diversas, o 2) que sirven para transportar nutrientes necesarios para el crecimiento de casi todo tipo de células.

Teniendo en cuenta la abundancia de los receptores gp18 y gp31 en tejidos diversos, su alta concentración en órganos de proliferación muy activa y el hecho de que los ligandos naturales de las gp18 y gp31 son "albúminas modificadas" (albúminas con un cambio conformacional, lo mismo que sucede con el LGF, que es una albúmina con un cambio conformacional específico, ligado a una aparición de la actividad biológica (véase Díaz Gil y cols., 1987)), los inventores pensaron que tal vez el LGF podría actuar como factor de crecimiento y regeneración en una gran diversidad de tejidos, al igual que habían demostrado anteriormente en hígado; en definitiva, decidieron comprobar la hipótesis de la validez del LGF como un factor de regeneración tisular de tipo pleiotrópico, que era nueva con respecto a otras estrategias de utilización del LGF planteadas hasta ese momento. Así, por ejemplo, en el año 1989, se había concedido la patente "Procedimiento para diagnóstico y seguimiento de hepatopatías mediante determinación del Factor de crecimiento de hígado en plasma y/o suero sanguíneo", núm. de publicación 2005259, pero en la correspondiente solicitud no se había contemplado el LGF como posible agente terapéutico.

Los inventores demostraron recientemente que la acción mitogénica ejercida en el hígado por el LGF está mediada, al menos en parte, por el TNF-α (Díaz Gil y cols., 2003). Este hecho les sirvió como un indicio de que el LGF podría presentar también acción mitogénica en otros tejidos en los que pueda expresarse la citada citoquina. Sin embargo, la elevación del TNF-α no produce por sí misma efectos mitógenicos; de hecho, está íntimamente ligado a la fase aguda, independientemente de su etiología: isquemia, traumatismo, inflamación, toxicidad (tal como revisaron Ding WX y cols., 2004, y Trauner M y cols., 1999) e, incluso, su inyección a ratas puede dar lugar a trastornos endocrinos y hematológicos (Kettelhut I y cols, 1987); además, está íntimamente relacionado con la muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis (revisado por Malhi H y cols., 2006). Dado que la estimulación del TNF-α está ligada tanto a efectos de estimulación mitogénica como a efectos de muerte celular, un aumento de su expresión inducido por LGF no describe de forma inequívoca la actividad del LGF. Además, el LGF es capaz de inducir mitosis en cultivo de hepatocitos (Díaz Gil y cols., 1986), en donde no hay células endoteliales presentes que pudieran producir TNF-α. Por ello, su posible utilidad para inducir proliferación de tejidos distintos del hepático e, incluso, el efecto que podía tener sobre ellos estaban por demostrar.

Siguiendo la línea de la posible validez del LGF como factor de regeneración tisular, los inventores demostraron recientemente la capacidad del LGF para reducir la hipertensión en ratas hipertensas produciendo una disminución de la fibrosis en la arteria carótida y aumentando el número de células de la musculatura lisa vascular pero sin alterar el diámetro interno o el espesor medio de dichas arterias (Somoza y cols., 2006).

También demostraron la capacidad del LGF para aumentar el número de terminales dopaminérgicos en modelos animales de la enfermedad de Parkinson (Reimers D. y cols., 2006). Se observó que el LGF produce un notable aumento de los terminales dopaminérgicos, así como una mejora en el comportamiento (test rotacional). Estos resultados abrieron una vía esperanzadora respecto a la posible utilidad del LGF en otros campos de gran interés. Los experimentos reflejados en esta publicación, sin embargo, se realizaron administrando el LGF a ratones por vía intrastriatal, es decir, administrándolo directamente al cerebro, sin necesidad de que se atraviese la barrera hematoencefálica. Esta vía de administración, desgraciadamente, es poco viable en seres humanos, lo que dificulta su aplicación clínica real para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en seres humanos.

Recientemente se ha demostrado también la capacidad del LGF, aplicado intraventricularmente, para promover la generación de nuevas neuronas y migración de las mismas en el estriado denervado (Gonzalo-Gobernado y cols., 2007).

Esta misma línea de investigación se vio reforzada por los hallazgos descritos en la solicitud de patente ES200601018. En ella se describe el uso del factor de crecimiento de hígado en la fabricación de un medicamento útil para la regeneración tisular pleiotrópica, basado en el efecto mitogénico en general y el efecto estimulador de la angiogénesis en particular que el LGF presenta en diversos órganos, tales como el testículo, la médula espinal o la piel, así como su actividad antifibrótica en arterias coronarias, su capacidad de reestructuración de las paredes de arterias coronarias y arterias de la circulación mayor y menor, su capacidad estimuladora de enzimas anticolesterolémicas como la paraoxonasa1 y el efector inhibidor del crecimiento de células de hepatocarcinoma. Estos efectos del LGF posibilitan su uso para el tratamiento de patologías como aterosclerosis, enfermedad coronaria, trombosis o carcinoma hepático, así como para ayudar en la recuperación de tejidos lesionados tales como los de testículo, médula espinal, corazón infartado, hueso fracturado, piel dañada o cualquier otro tejido cuya recuperación se acelere por estimulación de la angiogénesis.

El método de administración del LGF suministrado en los experimentos referidos a la regeneración de la médula espinal fue la inyección intraperitoneal del LGF. Se incluyeron dos situaciones diferentes: en la primera de ellas se produjo lesión traumática y trasplante de células fetales dos meses después, inyectándose LGF inmediatamente, 4 inyecciones en 2 semanas. En una segunda situación se produjo traumatismo o hemisección de la médula espinal, inyectándose LGF una semana después (4 inyecciones en 2 semanas). Ahora bien, debido a las características de los modelos empleados, la barrera hematoencefálica (BSCB, del inglés blood spinal cord barrier) estaba profundamente alterada como consecuencia de la agresión a la que fue sometida. Esta circunstancia ha sido profusamente estudiada por diversos autores: así, se conoce el daño inmediato producido en la BSCB después del trauma mecánico (Maikos y Shreiber, 2007). Para cuantificar esta permeabilidad, los investigadores han utilizado compuestos de bajo peso molecular, 14C-α-aminoisobutírico, detectándose mayor permeabilidad 28 días después del traumatismo (Popovich y cols., 1996), y compuestos de peso molecular más elevado: por ejemplo por infusión de 14C-albúmina (Wood y cols., 1999; Pettersson y cols, 1990; Sharma, 2004), por inyección de peroxidasa de rábano, HRP (Jaeger y cols., 1997), utilizando luciferasa (Whetstone y cols., 2003), o técnicas de resonancia magnética, MRI (Bilgen y cols., 2001; Bilgen y cols., 2002). Además, se detectó pérdida de albúmina en el sitio de la lesión por procedimientos inmunohistoquímicos (Gordh y cols, 2006), incluso diez semanas después del traumatismo, período superior al utilizado en los experimentos de las solicitudes de patente ES200801121 y PCT/ES2007/070080. De todo ello puede concluirse que el aumento de permeabilidad de la BSCB por efecto de traumatismo es un hecho probado por numerosos autores, conocido por los expertos en la técnica, que se produce en ambos sentidos, desde la médula hacia fuera y al contrario, y que se mantiene un tiempo superior al que comprende la inyección del LGF en la segunda situación descrita más arriba. Adicionalmente, en la primera situación, se inyectó LGF a los dos meses del traumatismo, previo trasplante de células fetales, pero precisamente este hecho altera igualmente la permeabilidad de la BSCB (Horner y cols, 1996), habiéndose detectado esta mayor permeabilidad hasta dos semanas después del trasplante.

Debido a estos hechos, un experto en la técnica consideraría que los efectos positivos del LGF observados en la regeneración de la médula espinal serían atribuibles al aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica que se produce por encontrarse ésta alterada, lo que posibilita que el LGF llegue a la médula sin necesidad de que la barrera hematoencefálica intacta sea permeable al mismo.

Además, los factores de crecimiento, en general, no son compuestos capaces de atravesar fácilmente la barrera hematoencefálica. Salvo en el caso del IGF (insulin-like growth factor: factor de crecimiento similar a la insulina) (Reinhardt y Bondy, 1994) se considera, en general, que el resto de los factores de crecimiento no atraviesan esta barrera. Aunque la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica no depende exclusivamente del tamaño, dado que el LGF tiene un peso molecular considerable, 64.000 kDa, esto hace a priori improbable que atraviese la barrera hematoencefálica.

Así, la búsqueda de agentes terapéuticos útiles para la regeneración de tejidos lesionados pertenecientes al sistema nervioso central y, con ello, la prevención y/o el tratamiento de trastornos o enfermedades en las que dichos tejidos están implicados, tales como la enfermedad de Parkinson, se ve dificultada, en general, por el problema de encontrar un compuesto que tenga la actividad terapéutica requerida y, al mismo tiempo, la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica, haciendo así posible su administración por vías practicables en seres humanos, tales como las que suponen la administración sistémica (intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, etc.).

La presente solicitud de patente ofrece una solución a este problema.

Breve descripción de la invención

La presente invención ofrece una solución al problema de la fabricación de medicamentos diseñados para ser administrados por vía sistémica, dirigidos al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que requieren la regeneración de tejido nervioso lesionado, al demostrarse en ella que el LGF, administrado por vía sistémica, es capaz de producir efectos en tejidos del sistema nervioso central que se encuentran, por tanto, al otro lado de la barrera hematoencéfalica. Así, la invención de la presente solicitud supone una mejora de la invención divulgada en la solicitud ES200601018, al demostrarse la utilidad específica del LGF para la regeneración de tejido nervioso perteneciente al sistema nervioso central aun cuando el LGF es administrado por una vía que implica que el efecto buscado debe producirse al otro lado de la barrera hematoencefálica.

El hecho de que el LGF, administrado por vía sistémica, sea capaz de ejercer un efecto al otro lado de la barrera hematoencefálica, permite el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que aquejan a mamíferos en los que la barrera hematoencefálica está intacta o mínimamente alterada, sin necesidad de administrar el medicamento por una vía que suponga la administración directa al sistema nervioso central, tal como la vía intracraneal: intrastratial, intratecal o intraventricular.

Así, el objeto de la presente invención es el factor de crecimiento de hígado (LGF) para su uso en la regeneración tisular de un tejido lesionado que forma parte del sistema nervioso central (SNC), caracterizado por que el LGF está en forma de un medicamento que está diseñado para ser administrado por vía sistémica y para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

Se prefiere particularmente que el medicamento esté diseñado para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, aunque también son realizaciones posibles de la invención aquellas en las que la enfermedad se selecciona entre otras enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Huntington, la ataxia y la esclerosis lateral amiotrófica. Sea cual sea la enfermedad, se prefiere muy especialmente que el individuo para el cual esté diseñado el medicamento sea un ser humano.

En otra realización preferida de la invención, el medicamento está diseñado para ser administrado por vía intravenosa o intraperitoneal.

La solicitud también divulga un uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad cuya gravedad o riesgo de empeoramiento disminuyen con la regeneración de uno o más tejidos, en los que dicho trastorno o enfermedad se selecciona entre las relacionadas con el sistema nervioso central, comprendiendo dicho método la administración a un ser humano o un animal de factor de crecimiento de hígado por vía sistémica. En una realización preferida del método de la invención, el LGF se administra por vía intraperitoneal. En otra realización preferida del método de la invención, el LGF se administra por vía intravenosa.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1A – 1D muestran los efectos de la inyección intraperitoneal de LGF en ratas con lesión estriatal con 6- OHDA.

- En A se muestra, en distintos cortes coronales, el porcentaje del área total del estriado con inervación TH- positiva en animales control (barra blanca) y en animales tratados con LGF (barra negra). En la parte derecha de la figura se indica la distancia, en milímetros, desde bregma a cada uno de los siete niveles del estriado en los que se realizaron los cortes coronales.

- En B se muestra el efecto de la solución salina (control) y LGF i.p. sobre el número de neuronas dopaminégicas de la substantia nigra sana (barras blancas) y lesionada (barras negras).

- En C se muestra el efecto de la administración i.p de solución salina (control) o LGF sobre la incorporación de BrdU en el estriado sano (barras blancas) y lesionado (barras negras).

- En D se muestra la conducta rotacional, valorada mediante el test de apomorfina, de los animales control (círculos vacíos) e inyectados i.p. con LGF (cuadrados negros).

Los resultados representan la media ± EEM de 5 (B y C), 10 (A) ó 15 (D) animales independientes. En A y B, *p≤0,05, **p≤0,01, ***p≤0,001 vs animales control. En B ***p≤0,001 vs lado control sano, ••p≤0,01 vs lado LGF sano. En C *≤p0,05, **≤p0,01 vs lado control lesionado

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha comentado previamente, el precedente más inmediato de la acción del LGF en cerebro es una publicación en la que se describe la acción del LGF, administrado por infusión intraestriatal, a ratas con enfermedad de Parkinson (Reimer y cols, 2006). La presente invención se refiere a los datos del LGF en el mismo modelo de Parkinson, administrando esta vez el LGF por vía intraperitoneal (el LGF tiene la misma actividad biológica por vía intravenosa). La diferencia en la vía de administración del LGF y su actividad en cerebro es un punto clave en la invención descrita en la presente solicitud de patente y está íntimamente relacionada con el concepto de barrera hematoencefálica (en adelante barrera hematoencefálica).

La barrera hematoencefálica fue descubierta en 1885 por Paul Ehrlich, quien por inyección intravenosa del colorante azul tripán a conejos, observó que se teñían todos los órganos por igual, a excepción del cerebro. Ochenta años después se descubrió que la barrera hematoencefálica está constituida por las células endoteliales de los capilares del cerebro, que tienen unas uniones muy bien selladas y constituyen una barrera física muy efectiva (Reese y cols, 1967). La penetración a través de la barrera hematoencefálica no es una cuestión de tamaño molecular solamente, ya que el 98% de las moléculas pequeñas, de peso molecular menor de 400, no atraviesan la barrera hematoencefálica. De la misma forma, los productos de biotecnología de mayor tamaño, como anticuerpos monoclonales, proteínas recombinantes, compuestos de ARN “antisentido” o productos de genes no atraviesan la barrera hematoencefálica (véase Pardridge, 2005 para una revisión). De forma análoga, a priori parece poco probable que el LGF, que es una molécula de gran tamaño, puede atravesar la barrera hematoencefálica.

A pesar del gran número de pacientes con desórdenes del SNC y del pequeño número de moléculas que atraviesan la barrera hematoencefálica, menos del 1% de las compañías farmacéuticas tienen programas específicos para investigar productos para solventar este problema. Los pocos componentes de bajo peso molecular de utilización en el cerebro se han centrado fundamentalmente en el tratamiento de la depresión, esquizofrenia, dolor crónico y epilepsia, y en el caso de la enfermedad de Parkinson únicamente se ha utilizado la administración de L-DOPA, un precursor de la dopamina (Lloyd y cols, 1970). Para tratar de solucionar este problema se han ideado varias estrategias basadas en el transporte mediado por receptores, anticuerpos monoclonales utilizados como “caballos de Troya”, enmascarando moléculas de acción terapéutica, como proteínas recombinantes, anticuerpos, ARN de interferencia y algunos otros (véase Pardridge, 2007, para una revisión reciente).

Estrechamente relacionado con este punto es la conocida actividad de otros factores de crecimiento que han demostrado actividad cuando se perfunden intracranealmente en modelos experimentales de Parkinson: el factor de crecimiento transformante tipo alfa, TGF-α (Fallon y cols, 2000), el factor de crecimiento de endotelio vascular, VEGF (Sun y cols, 2003), el factor neurotrófico derivado de líneas de células gliales, GDNF, o la combinación de éste y el factor neurotrófico derivado de cerebro, BDNF (Torp y cols, 2006). En todos los casos, aunque se ha demostrado actividad cerebral por infusión intracreaneal, no se ha demostrado que actúen por vía intravenosa ni intraperitoneal, posiblemente porque no cruzan la barrera hematoencefálica.

Debido a lo mencionado anteriormente, cabría esperar que la acción del LGF sobre cerebro por vía intracraneal no asegurara que dicho LGF tuviera efecto biológico por vía intravenosa o intraperitoneal cuando la barrera hematoencefálica se encuentra intacta.

Sin embargo, investigaciones posteriores a la presentación de la solicitud de patente ES200601018 demostraron un sorprendente efecto de la acción del LGF, administrado de forma intraperitoneal, en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en mamíferos con la barrera hematoencefálica intacta, tal como se expone más adelante en los ejemplos de la presente memoria, en la que se muestran los resultados de la inyección del LGF por vía intraperitoneal.

Dado que los experimentos relativos a la administración del LGF para la regeneración de la médula espinal, descritos en la solicitud de patente ES200601018, muestran que el LGF es capaz de regenerar el tejido de la médula espinal dañada, puede considerarse que el LGF tiene capacidad para regenerar, en general, tejido nervioso del sistema nervioso central. Por ello, su uso puede extenderse a la fabricación de medicamentos para el tratamiento de cualquier enfermedad neurodegenerativa que requiera la regeneración de tejido nervioso, en el que el medicamento se diseñe para ser administrado por vía sistémica, dando lugar a una mejoría de las situaciones patológicas descritas y un efecto estimulador de procesos regenerativos en distintos tejidos.

Adicionalmente, en el Ejemplo 2 de la presente solicitud de patente, se muestra que el LGF, inyectado por vía intraperitoneal, es capaz de estimular la ruta de la serotonina en cerebro en ratas intactas. La serotonina es un neurotransmisor con funciones muy diversas, actuando e influyendo decisivamente en muchas situaciones. Así, se conoce su participación en el desarrollo cerebral (Azmitia y cols, 2007), en la memoria (Buhot y cols, 2000), en la enfermedad de Alzheimer (Meltzer y cols, 1998), en la epilepsia (Bagdy y cols, 2007), en el sueño (Gao y cols, 2002), en la demencia (Yan y cols, 2001), en la depresión (Grahame-Smith y cols., 1992), en la anorexia y bulimia (Kaye y cols, 2005), y en otras muchas (véase Smythies y cols, 2005 para una revisión).

La activación de la ruta de la serotonina promovida por el LGF administrado por vía intraperitoneal apoya más la utilidad del LGF para otras enfermedades neurodegenerativas distintas de la enfermedad de Parkinson, tales como la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotróficas, ataxias, etc.

El hecho de el que LGF sea capaz de ejercer un efecto sobre el sistema nervioso central cuando se administra por vía sistémica implica que, cualquiera que sea la vía de administración específica que se emplee, siempre y cuando dé lugar a que el LGF llegue al sistema sanguíneo y pueda llegar a la barrera hematoencefálica por vía sistémica, el medicamento tendrá capacidad para producir un efecto terapéutico en la enfermedad neurodegenerativa deseada.

Por ello, son realizaciones posibles de la invención no sólo aquéllas en las que el medicamento se diseña para ser administrado por vía intraperitoneal, como en los ejemplos de la invención, sino también aquéllas en las que el medicamento se diseña para ser administrado por vía intravenosa.

En cuanto a la composición del medicamento, se prefiere aquellos que incluyen un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, en el que se disuelva el LGF. Se prefiere particularmente el medio salino y, muy particularmente, medio salino hipotónico. Adicionalmente, el medicamento puede contener cualquier excipiente farmacéuticamente adecuado, tal como, por ejemplo, uno o más estabilizantes. Otra posibilidad por la que se tiene especial preferencia es por aquélla en la que el medicamento incluye el LGF en forma liofilizada, en un recipiente cerrado al vacío, siendo opcional la presencia adicional del vehículo salino en el mismo medicamento; esta presentación permite la preparación de la disolución del LGF poco antes de su administración.

La presente invención se explicará ahora con más detalle por medio de los Ejemplos y Figuras que se muestran a continuación.

Ejemplos

Ejemplo 1: Efectos de la administración intraperitoneal de LGF sobre la inducción del crecimiento axonal y la neurogénesis Dado que los resultados mostrados en el artículo de Reimers y colaboradores, fundamentan el posible uso del LGF en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, se realizó el presente experimento para comprobar si, al administrar el LGF por una vía que implicara que los efectos ensayados deben evaluarse al otro lado de la barrera hematoencefálica, se observaban también efectos positivos en un modelo de dicha enfermedad.

Así, para comprobar la posibilidad de que el LGF pueda ser utilizado como instrumento terapéutico administrado por una vía cuya utilización sea factible en seres humanos, en el modelo experimental de enfermedad de Parkinson descrito por Kirik y cols. (1998) se investigaron los efectos de la administración intraperitoneal de LGF sobre la inducción del crecimiento axónico y la neurogénesis.

El modelo experimental de enfermedad de Parkinson utilizado comprende la aplicación unilateral de 4 inyecciones de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en diferentes lugares del estriado derecho de ratas hembra Sprague-Dawley de 200-220 g de peso. Para ello se utilizó una microjeringa Hamilton de 10 µl, a una velocidad de inyección de 1 µl/min. Tras la aplicación de la neurotoxina, la cánula se mantuvo durante 2 min adicionales antes de ser extraída lentamente. La dosis y coordenadas utilizadas se seleccionaron sobre la base de otros trabajos (Kirik y cols., 1998). Concretamente, la 6-OHDA se suministró a una concentración de 3,5 µg/µl, 2 µl por inyección (7 µg de 6-OHDA por inyección). Las coordenadas estereotáxicas (AP: anteroposterior; L: lateral; V: ventral) relativas a la bregma (punto de la superficie craneal situado en la unión de las suturas coronal y digital) y la dura, de cada inyección, fueron las siguientes: -1: AP: + 1,3 mm; L: + 2,6 mm; V: -5,0 mm -2: AP: + 0,4 mm; L: + 3,0 mm; V: -5,0 mm -3: AP: -0,4 mm; L: +4,2 mm; V: -5,0 mm -4: AP: -1,3 mm; L: +4,5 mm; V: -5,0 mm En todos los casos, la barra de incisión se dejó ajustada a 0 mm.

Para determinar el grado de lesión, se realizó un test de conducta rotacional a los 15 días (inyección subcutánea de apomorfina 0,05 mg/kg). La inyección de apomorfina induce un comportamiento rotacional contralateral a la lesión. Se consideraron lesionados a los animales que rotaron 100 o más vueltas en 15 minutos, descartándose los que no cumplieron este criterio. Durante el período previo al tratamiento con LGF, se realizaron test periódicos semanales de rotación, con el fin de asegurar la total instauración de la lesión.

Ocho semanas después de la lesión los animales se dividieron en dos grupos: tratados con LGF (n=18) y tratados con vehículo (n=15). El tratamiento con LGF se llevó a cabo como sigue: el LGF (5,0 µg/rata) se inyectó intraperitonealmente 6 veces a intervalos de 3 días (días 0, 3, 6, 9, 12 y 15), manteniéndose durante cuatro semanas adicionales (los controles se inyectaron con solución salina durante este mismo tiempo). Al tiempo indicado, los animales se sacrificaron y fijaron por perfusión intracardíaca con paraformaldehído al 4% en PBS. Los cerebros fueron congelados y se realizaron cortes de 20-30 µm en el criostato. Las secciones se incubaron con anticuerpos específicos para tirosina hidroxilasa (TH, Chemicon Internacional, Temecula, CA), neuronas (b-tubulina III, Bab Co, Richmond, CA, y doblecortina, Chemicon International Inc.), glía (GFAP, DakoCytomation Inc., y O1, Sigma Chemical Co, St Luis, MO) y precursores neurales (nestina, Development Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, IA).

Los resultados representan la media ± EEM de 4 a 10 animales independientes. El análisis inmunohistoquímico se realizó utilizando un microscopio de epifluorescencia acoplado al software de análisis estereológico CAST-GRID. En cada animal se valoró la fluorescencia incluida en el área del estriado de cortes histológicos previamente seleccionados mediante coordenadas anteroposteriores definidas. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor seguido de un t-test no pareado o del test de Bonferroni para comparaciones múltiples, y las diferencias se consideraron significativas para p≤0,05.

1.1.- Efectos del LGF sobre la inervación dopaminérgica Para determinar el grado de degeneración de los terminales dopaminérgicos nigroestriatales provocado por la lesión con 6-OHDA un grupo de animales (n=4) se sacrificó a las 8 semanas post-lesión. El análisis inmunohistoquímico de secciones coronales de 7 niveles diferentes del estriado mostró que aproximadamente el 30-40% de la superficie del estriado ipsilateral a la lesión está inervado con fibras inmunopositivas para la enzima limitante de la síntesis de catecolaminas, TH. Resultados similares se obtuvieron en el grupo de animales sacrificados a las 10 semanas post- lesión y que recibieron 6 inyecciones intraperitoneales (i.p.) de vehículo. La administración intraperitoneal de LGF incrementó significativamente la inervación TH-positiva en casi todos los niveles del estriado analizados, siendo este efecto mas destacado en los niveles más anteriores (Fig. 1A).

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por la pérdida de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra (SN) que proyectan en el estriado. La preservación del daño neuronal ejercido por la 6-OHDA en estas neuronas podría contribuir al aumento de inervación observado en los animales tratados con LGF. Sin embargo, la pérdida de neuronas TH-positivas en la SN de los animales tratados con LGF fue similar a la observada en los animales tratados con vehículo (Fig. 1B).

Como hemos comentado, el LGF promueve la neurogénesis en ratas hemiparkinsonianas (Gonzalo-Gobernado y col., 2007). Para determinar si la generación de nuevas neuronas dopaminérgicas podría contribuir al aumento en la inervación TH-positiva observada en los animales tratados intraperitonealmente con LGF, un grupo de ratas hemiparkinsonianas recibió una inyección intraperitoneal diaria de 50 mg/kg de bromodeoxiuridina (BrdU) durante tres semanas, iniciándose el tratamiento 24 horas después de la primera inyección de vehículo o LGF. La lesión intraestriatal con 6-OHDA incrementó en un 300% la incorporación de BrdU el estriado denervado de estos animales. El análisis inmunohistoquímico de secciones coronales de 1 nivel del estriado (AP: -1,8) de los animales tratados con vehículo mostró resultados similares (Fig. 1C). Sin embargo, la administración intraperitoneal de LGF no afectó a la proliferación, ya que el número de células BrdU-positivas fue similar en el estriado sano y el estriado denervado de estos animales (Fig. 1C). Independientemente de los cambios en proliferación descritos, en ninguno de los grupos experimentales estudiados se observaron comarcajes en el parénquima estriatal de las células BrdU- positivas con marcadores neuronales (β tubulina III o doblecortina) y/o TH. Por otro lado, y aunque recientemente se ha demostrado que en la SN de ratas sanas y ratas con lesión con 6-OHDA se estimula la neurogenesis (Zhao y col., 2003), no se observaron células BrdU-/TH-positivas en la SN de los animales tratados con LGF.

De este conjunto de resultados se puede concluir que la administración intraperitoneal de LGF, al igual que la administración intraestriatal del factor, promueve el rebrote de los terminales TH-positivos en el estriado de ratas con lesión intraestriatal con 6-OHDA.

1.2.- Efectos de la administración intraperitoneal de LGF sobre la conducta rotacional

Los trabajos previos del grupo de los inventores indican que el LGF administrado en el estriado denervado de ratas hemiparkinsonianas promueve una discreta mejoría en la conducta rotacional inducida por apomorfina (Bazán y cols., 2005, Reimers y cols., 2006). Para determinar si la administración intraperitoneal de LGF también es capaz de restaurar la función motora, se evaluaron en las ratas con lesión unilateral del estriado con 6-OHDA las rotaciones inducidas por apomorfina semanalmente antes, durante, y dos semanas después del periodo de tratamiento con el factor.

Tal y como se demuestra en la Fig. 1D, los animales tratados con vehículo no presentaron cambios significativos en la conducta rotacional inducida por apomorfina durante el periodo de estudio. Sin embargo, 4 semanas después del inicio del tratamiento con LGF, se observó una disminución significativa en el número de giros contralaterales inducidos por apomorfina en este grupo experimental, manteniéndose este efecto durante las cuatro semanas posteriores a la finalización del tratamiento con el factor.

Podemos concluir, por tanto, que la administración intraperitoneal de LGF estimula la regeneración de los terminales dopaminérgicos dañados en el estriado de ratas hemiparkinsonianas. Puesto que esta vía del LGF también promueve una mejoría conductual significativa, proponemos el LGF como un nuevo factor de utilidad en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Ejemplo 2: Estimulación de la ruta de la serotonina en cerebro por inyección del LGF por vía intraperitoneal A continuación se describen los experimentos llevados a cabo para la demostración de la actividad de estimulación del LGF, inyectado por vía intraperitoneal (i.p.) a ratas normales, en la ruta de la serotonina en cerebro.

Se estudió el posible efecto del LGF sobre la actividad serotoninérgica en el estriado, hipotálamo e hipocampo de rata. Los animales fueron tratados con LGF (5 µg/rataXdía, intraperitoneal) los dos días anteriores al del sacrificio. Al grupo de animales controles se le inyectó solución salina en un volumen idéntico al de los animales experimentales.

La actividad serotoninérgica se evaluó a partir de la acumulación del 5-HTP (5-hidroxitriptófano) tras inhibir la descarboxilasa con el compuesto NSD-1015 (Sigma Co.). Este compuesto se administró (125 mg/Kg, i.p.) a los dos grupos de animales que se sacrificaron una hora después de la administración de LGF o solución salina. Los animales se decapitaron y, rápidamente, el cerebro se extrajo sobre hielo, procediéndose a la disección del estriado y del hipocampo derechos. El resto del cerebro se guardó congelado para una posterior disección del hipotálamo. Las muestras de tejidos se homogenizaron por sonicación en ClO4H 0,4 N con 0,002% de ácido ascórbico, se centrifugaron y el sobrenadante se utilizó para determinar el contenido de 5-HTP por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) en fase reversa y detección electroquímica. Los procedimientos vienen detallados en Marco y cols, 1979, Marco y cols, 1999). El precipitado se redisolvió en NaOH 0,5 N para determinar las proteínas y la concentración final de 5-HTP se obtuvo en relación con estas. Los resultados se expresaron como la media ± EEM.

Los resultados, que se muestran en la Tabla 1, indican un aumento significativo de la acumulación 5-HTP tanto en el estriado como en el hipocampo o en el hipotálamo tras el tratamiento de los animales con LGF, lo que, funcionalmente, se interpreta como un aumento de la actividad serotoninérgica en estas áreas cerebrales.

Tabla 1.- Niveles de 5-http en cerebro de animales tratados con LGF

TEJIDO TRATAMIENTO 5-HTP (pmoles/mg prot.) n (nº de muestras) Estriado Control 10,88 ± 0,71 12 LGF 13,20 ± 0,75* 12 Hipocampo Control 8,03 ± 0,35 12 LGF 10,30 ± 0,60** 12 Hipotálamo Control 26,55 ± 0,99 12 LGF 30,13 ± 1,35* 12 *p<0,05 al comparar con el control **p>0,005 al comparar con el control Dada la actividad del LGF sobre la enfermedad de Parkinson, inyectado por vía intraperitoneal, así como la actividad sobre la ruta de la serotonina, que podría implicar su acción en varias situaciones muy diferentes, es de esperar que el LGF tenga actividad regeneradora y reparativa en otras enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, ataxias, etc.

Referencias bibliográficas

- Abakumova y cols., J. Hepatology, 21:947-952, 1994 - Azmitia EC y cols., Int Review Neurobiol, 77:51-56, 2007.

- Bagdy G y cols, J Neurochem, 100:857-73, 2007.

- Bazán E, y cols., Mapfre Medicina, 16: 237-247, 2005.

- Bilgen M, y cols., Magnetic Res in Med, 45:614-22, 2001.

- Bilgen M, y cols., Magnetic Res in Med, 20:337-41, 2002.

- Buhot MC y cols., Ann Med, 32:210-21, 2000.

- Díaz Gil y cols., Biochem J, 234:49-54, 1986.

- Díaz Gil y cols., Biochem J., 243:443-448, 1987.

- Díaz Gil y cols., Hepatology, 8:484-486, 1988.

- Díaz Gil y cols., Mol. Biol & Medicine, 6:197-207, 1989.

- Díaz Gil y cols., Growth Regulation, 4:113-122, 1994a.

- Díaz Gil y cols., NATO ASI Series "Cell Biology", vol. 88:275-288, 1994b.

- Díaz Gil y cols., J Hepatology, 6:1065-1072, 1999.

- Díaz Gil y cols., J Hepatology, 38:598-604, 2003.

- Ding WX y cols., J Cell Mol Med, 8(4):445-54, 2004.

- Fallon J, y cols., Proc Nat Acad Scienc USA, 97:14686-91, 2000.

- Gao J y cols., Brain Res, 945:60-70, 2002.

- Ghinea y cols., J. Cell Biol., 107:231-239, 1988 - Gonzalo-Gobernado R, y cols., Revista de Neurología, 45:187, 2007.

- Gordh T, y cols., Pain, 124:211-21, 2006.

- Grahame-Smith DS y cols, Int Clin Psychopharmacol, 6 (suppl 4) :5-13 ;1992.

- Horner PJ, Exp Neurol, 142:226-43, 1996.

- Jaeger CB, y cols., Exp Neurol, 144(2):381-99, 1997.

- Kaye WH y cols, Physiology & Behaqviour, 82:73-81, 2005.

- Kettelhut I y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4273-7, 1987.

- Kirik D, y cols., Exper Neurol 152: 259-277, 1998.

- Lloyd H, y cols. Sce, 170:1212-13, 1970.

- Maikos JT, J Neurotrauma, 24:492-507, 2007.

- Malhi H y cols., Hepatology, 43:S31-S44, 2006.

- Marco EJ y cols., Nauny-Scmiedeberg`s Arch Pharmacol, 306:75-9, 1979.

- Marco EJ y cols, Stroke, 30:1695-1701, 1999.

- Meltzer CC y cols, Neuropsychopharmacology, 18:407-430, 1998.

- Morioanu y cols., Eur. J. Cell Biol., 53:20-26, 1990.

- Pardridge WP, Am Soc Exp NeuroTher, 2:3-14, 2005.

- Pardridge WP, Pharmaceutical Res, 24:1733-44, 2007.

- Pettersson CA, y cols., Acta Neurol Scand, 82:21-7, 1990.

- Popovich PG, y cols., Exp Neurol, 142:258-75, 1996.

- Reese TS, y cols., J Cell Biol, 4:200-17, 1967.

- Reimers, D, y cols., J Histochem Cytochem, 54:457-65, 2006.

- Reinhardt RR and Bondy CA, Endocrinology, 135:1753-61, 1994.

- Sharma HS, “The blood-spinal cord and brain barriers in health and disease”, Academic Press, Elsevier, págs. 437- 518, 2004.

- Schnitzer y cols., J. Biol. Chem., 267:24544-53, 1992.

- Smythies J y cols, Int Review Neurobiol, 64:217-68, 2005.

- Somoza y cols., Cardiovascular Research, 69(3):764-71, 2006.

- Sun Y, y cols., J Clin Invest, 111:1843-51, 2003.

- Torp R y cols, Tidsskr Nor Laegeforen, 126:899-901, 2006.

- Trauner M y cols., J Gastroentrol Hepatol, 14:946-59, 1999 - Whetstone WD, y cols., J Neurosci Res, 74:227-39, 2003.

- Wood JD, y cols., J Neurosurg, 90(1 Suppl):115-20, 1999.

- Yan QS y cols, Acta Neuropathol (Berl), 101:256-70, 2001.

- Zhao M, y cols, Proc Natl Acad Sci USA, 100:7925-7930, 2003.

REIVINDICACIONES

1.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas en la regeneración tisular de un tejido lesionado que forma parte del sistema nervioso central, caracterizado por que el LGF está en forma de un medicamento que está diseñado para ser administrado por vía sistémica. 2.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso según la reivindicación 1, caracterizado por que el medicamento está diseñado para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

3.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso según la reivindicación 1, caracterizado por que el medicamento está diseñado para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa que se selecciona entre enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica o ataxia. 4.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el medicamento está diseñado para individuos con la barrera hematoencefálica intacta. 5.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el medicamento está diseñado para ser administrado a un ser humano.

6.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el medicamento está diseñado para ser administrado por vía intraperitoneal. 7.

Factor de crecimiento de hígado (LGF) para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el medicamento está diseñado para ser administrado por vía intravenosa.