Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

USO DEL ENANTIÓMERO (1S,2R) DEL MILNACIPRÁN PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO.

Patente Europea. Resumen:

Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida)

, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su utilización como medicamento destinado a prevenir o a tratar la depresión, los estados depresivos, la fibromialgia, el síndrome de fatiga crónica, el dolor, en pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares y/o que padecen trastornos cardiovasculares, administrado a una dosis comprendida entre 0,01 mg y 10 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas.

Solicitante: PIERRE FABRE MEDICAMENT.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 45, PLACE ABEL GANCE 92100 BOULOGNE-BILLANCOURT FRANCIA.

Inventor/es: DEREGNAUCOURT,JEAN, GROSSE,RICHARD.

Fecha de Publicación de la Concesión: 23 de Mayo de 2011.

Fecha Solicitud PCT: 16 de Febrero de 2004.

Clasificación Internacional de Patentes: A61K31/135 (..que tienen ciclos aromáticos, p. ej. metadona [2,7]), A61K31/195 (...que tienen un grupo amino [2,7]), A61K31/167 (...teniendo el átomo de nitrogeno de un grupo carboxiamida unido directamente al ciclo aromático, p.ej. lidocaina, paracetamol [7]), A61K31/165 (..teniendo ciclos aromáticos, p.ej. colchicina, atenolol, progabide [2]), A61K31/4015 (....teniendo grupos oxo unidos directamente al heterociclo, p.ej. piracetam, etosuximida [7]).

Clasificación PCT: A61K31/135 (..que tienen ciclos aromáticos, p. ej. metadona [2,7]), A61K31/165 (..teniendo ciclos aromáticos, p.ej. colchicina, atenolol, progabide [2]).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

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Ilustración 1 de USO DEL ENANTIÓMERO (1S,2R) DEL MILNACIPRÁN PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO.
Ilustración 2 de USO DEL ENANTIÓMERO (1S,2R) DEL MILNACIPRÁN PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO.
Ilustración 3 de USO DEL ENANTIÓMERO (1S,2R) DEL MILNACIPRÁN PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO.
Ilustración 4 de USO DEL ENANTIÓMERO (1S,2R) DEL MILNACIPRÁN PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO.
Descripción:

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La presente invención se refiere al enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1fenilciclopropanocarboxamida), o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su utilización como medicamento destinado a prevenir o a tratar la depresión, los estados depresivos, la fibromialgia, el síndrome de fatiga crónica, el dolor, en pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares y/o que padecen trastornos cardiovasculares, administrado a una dosis comprendida entre 0,01 mg y 10 mg/kg de peso corporal por día en una

o varias tomas.

El Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), molécula sintetizada en el Centro de Investigación PIERRE FABRE MEDICAMENT (Castres, Francia), también denominado TN-912, Dalciprán, Milnaciprán, Midalciprán o Midaliprán, se conoce como inhibidor doble de la recaptura de la serotonina (5-HT) y de la noradrenalina (NA). El Milnaciprán y su procedimiento de preparación se describen en la patente US nº 4.478.836. Otras informaciones relativas al Milnaciprán se pueden encontrar en la duodécima edición del índice Merck, con la entrada nº 6281.

Los inhibidores dobles de la recaptura de la serotonina y de la noradrenalina corresponden a una clase bien conocida de agentes antidepresivos que inhiben de manera selectiva la recaptura al mismo tiempo de la serotonina y de la noradrenalina. A título de ejemplo, la venlafaxina y la duloxetina son asimismo unos inhibidores dobles de la serotonina y de la noradrenalina. Unos estudios han mostrado que el ratio entre la inhibición de la recaptura de la noradrenalina y la inhibición de la serotonina mediante el Milnaciprán es de aproximadamente 2:1 (Moret et al., 1985 Neuropharmacology 24(12): 1211-1219; Palmier et al., 1989, Eur. J. Clin. Pharmacol 37: 235-238).

La patente US nº 4.478.836 describe el uso del Milnaciprán para el tratamiento de patologías del sistema nervioso central, en particular de la depresión. La solicitud de patente WO 01/26623 describe el uso del Milnaciprán en asociación con fenilalanina y tirosina en unas indicaciones tales como el tratamiento de la fatiga, de los síndromes asociados con el dolor, del síndrome de la fatiga crónica, de la fibromialgia, del síndrome del intestino irritable. La solicitud de patente WO 01/62236 describe una composición que comprende Milnaciprán en asociación con uno o varios agentes anti-muscarínicos en un gran número de indicaciones incluyendo la depresión. La solicitud WO 97/35574 describe una composición farmacéutica que contiene Milnaciprán e idazoxano como producto de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo para tratar la depresión y sus diferentes formas, así como las patologías en las que se usan los antidepresivos. El Milnaciprán se usa asimismo en una indicación de tratamiento de la incontinencia urinaria (FR 2 759 290).

La molécula de Milnaciprán posee dos carbonos asimétricos que llevan a dos configuraciones espaciales diferentes (1S,2R) y (1R,2S). Siendo estas configuraciones espaciales no superponibles, la molécula de Milnaciprán presenta por lo tanto una isomería óptica.

El clorhidrato de Milnaciprán existe así en forma de dos enantiómeros ópticamente activos: el enantiómero dextrógiro o también clorhidrato de Z-(1S,2R)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida y el enantiómero levógiro clorhidrato de Z-(1R, 2S)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida. El Milnaciprán en su forma de clorhidrato (también denominado F2207) está actualmente comercializado (IXEL, PIERRE FABRE MEDICAMENT, Francia) en forma de mezcla racémica como medicamento antidepresivo serotoninérgico-noradrenérgico. F2695 y F2696 designan, respectivamente, los enantiómeros (1S,2R) (dextrógiro) y (1R,2S) (levógiro) del clorhidrato de Milnaciprán (F2207):

**(Ver fórmula)**

Estos dos enantiómeros pueden estar separados o aislados según unos procedimientos descritos en la bibliografía (Bonnaud et al., 1985, Journal of Chromatography, Vol. 318: 398-403; Shuto et al., Tetrahedron letters, 1996 Vol. 37:641-644; Grard et al., 2000, Electrophoresis 2000 21: 3028-3034; Doyle y Hu, 2001, Advanced Synthesis and Catalysis, Vol. 343: 299-302).

Los inventores han realizado ahora un estudio farmacocinético en el ser humano del racemato y de los dos enantiómeros del Milnaciprán que usa unos métodos de dosificación de enantio-selectividad. Así, han demostrado la ausencia de racemización de los enantiómeros in vivo.

Por otra parte, aunque el racemato haya sido resuelto, no se ha realizado ningún análisis de las propiedades farmacológicas y toxicológicas de los dos enantiómeros, que usa los métodos modernos actualmente a disposición tales como las mediciones cardiovasculares por telemetría, o los análisis de predictividad farmaco-toxico-genómica in vitro.

Los antidepresivos, como cualquier principio activo, pueden generar unos efectos indeseables o ciertas toxicidades que resultan esencialmente de las propiedades farmacológicas de estos medicamentos, pero asimismo de la posología, de la variabilidad individual del paciente (polimorfismo genético, insuficiencia orgánica, sexo, edad) o de interacciones medicamentosas. Así, los antidepresivos representan la tercera clase de productos responsables de intoxicación, después de los hipnóticos y de los tranquilizantes (Nores et al., 1987 Thérapie 42: 555-558). El riesgo de sobredosis con unos antidepresivos es grave puesto que puede llevar a la muerte. Entre las causas de intoxicaciones agudas mediante los antidepresivos, conviene citar la ingesta involuntaria por los niños (considerando que ciertos antidepresivos se usan para el tratamiento de la enuresis), el intento de suicidio, la sobredosis involuntaria por el médico, la co-medicación asociada en la persona mayor, las modificaciones fisiológicas y farmacocinéticas relacionadas con la edad (insuficiencia cardiaca, insuficiencia hepática y/o renal, etc.), un metabolismo ralentizado de origen genético o medicamentoso (inhibición enzimática). Después de los niños, la persona mayor constituye por lo tanto la segunda población de riesgo entre los pacientes tratados. Estas personas tienen unas concentraciones plasmáticas más elevadas, relacionadas con una aclaración renal y/o hepática disminuida, y los riesgos de intoxicación son más graves (Meadoer-Woodruff et al., 1988 J. Clim. Psychopharmacol.

8: 28-32).

Los efectos secundarios indeseables, generalmente benignos, observados durante el tratamiento por el Milnaciprán se observan sobretodo durante la primera, incluso las dos primeras semanas del tratamiento, y se difuminan después, paralelamente con la mejora del episodio depresivo. Los eventos indeseables relatados más comúnmente en monoterapia, o durante una asociación con otros psicótropos son unos vértigos, una hipersudoración, la ansiedad, unos sofocos, y la disuria. Ciertos efectos indeseables relatados menos comúnmente son unas nauseas, unos vómitos, una sequedad bucal, un estreñimiento, unos temblores, unas palpitaciones, una agitación, unas erupciones cutáneas. Por otra parte, se conoce en los pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares

o que reciben simultáneamente un tratamiento con diana cardiaca, que la incidencia de los efectos indeseables de naturaleza cardiovascular (hipertensión, hipotensión, hipotensión ortostática, palpitaciones) puede estar aumentada por el Milnaciprán. En los pacientes hipertensos o que padecen cardiopatías, se recomienda así reforzar la vigilancia clínica porque el Milnaciprán en forma de mezcla racémica es susceptible de aumentar la frecuencia cardiaca. Así, durante raros casos de sobredosis observados con el Milnaciprán (con dosis de 800 mg a 1 g) en monoterapia, los principales síntomas observados son los vómitos, los trastornos respiratorios y una taquicardia (Dictionnaire Vidal, 78ª edición, 2002). Otro efecto indeseable excepcionalmente inducido por el Milnaciprán es un aumento elevado de las transaminasas, que puede traducir una cierta toxicidad hepática.

De hecho, las poblaciones de riesgo susceptibles de desarrollar un cierto número de manifestaciones clínicas indeseables durante o después de un tratamiento por el Milnaciprán, son los insuficientes hepáticos y/o renales, los pacientes que reciben un tratamiento que induce unas toxicidades orgánicas y/o tisulares, en particular unas toxicidades hepáticas y/o renales, los pacientes que reciben un tratamiento con diana cardiaca o que inducen unos efectos secundarios cardiovasculares, los pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares y/o que padecen trastornos cardiovasculares, en particular los pacientes que presentan unos trastornos del ritmo cardiaco, de la presión arterial (pacientes hipo-o hipertensos) o lo pacientes que padecen cardiopatías.

Con la preocupación de prevenir, siempre antes, la aparición de eventuales efectos secundarios susceptibles de constituir un riesgo, lo más mínimo que sea, para la salud de los pacientes tratados con Milnaciprán, los inventores han descubierto ahora, de manera sorprendente e inesperada, que el enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán, que presenta lo esencial de la actividad de inhibición selectiva de la recaptura de la serotonina y de la noradrenalina, induce menos efectos secundarios de naturaleza cardiovascular y de toxicidad orgánica y/o tisular, en particular hepática, que la mezcla racémica. En particular, los inventores han descubierto que la administración en el perro del enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán provoca un menor aumento de la frecuencia cardiaca y de la presión arterial, en particular de la presión arterial diastólica, que la susceptible de ser provocada por la administración de la mezcla racémica. Los inventores han descubierto además que el enantiómero (1S,2R) del clorhidrato de Milnaciprán (F2695) presenta un mejor perfil toxico-genómico que el enantiómero (1R,2S) del clorhidrato de Milnaciprán (F2696) sobre un modelo experimental de hepatocitos primarios de rata. Además, los inventores han demostrado que el enantiómero (1R,2S) (F2696) presenta un perfil toxico-genómico parecido al obtenido con la Clomipramina, usada como psicótropo de referencia conocida por su relativa hepatotoxicidad.

La presente invención tiene por lo tanto por objeto el enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,Ndietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su utilización como medicamento destinado a prevenir o a tratar la depresión, los estados depresivos, la fibromialgia, el síndrome de fatiga crónica, el dolor, en pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares y/o que padecen trastornos cardiovasculares, administrado a una dosis comprendida entre 0,01 mg y 10 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas.

5 Mediante la expresión “trastornos cardiovasculares” se entiende unos efectos secundarios cardiovasculares indeseables del medicamento administrado en mono-terapia o en asociación con otros principios activos.

En el sentido de la presente invención, se entiende mediante la expresión “efecto secundario” la actividad previsible de un medicamento en un campo distinto a aquél para el cual se administra, que puede ser molesta o indeseable cuando limita el uso del medicamento.

Por el término “toxicidad”, se entiende la propiedad de un medicamento para provocar unos efectos nocivos a nivel orgánico y/o tisular, en particular a nivel de los órganos o tejidos implicados en el metabolismo del Milnaciprán, en particular el metabolismo hepático y/o renal del Milnaciprán, y más particularmente durante el primer paso del Milnaciprán a nivel hepático. Preferentemente, la toxicidad orgánica es la toxicidad cardiaca, y dicha toxicidad tisular es la toxicidad hepática y/o renal.

En el ámbito de la presente invención, se entiende mediante la expresión “limitando al mismo tiempo los riesgos de trastornos cardiovasculares” o “limitando al mismo tiempo los riesgos de toxicidad” el hecho de impedir que estos riesgos aumenten significativamente en un paciente tras la administración del medicamento.

En el ámbito de la presente invención, la expresión “enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán” designa el enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán, así como las sales farmacéuticamente aceptables de éste. Preferentemente, se trata del enantiómero (1S,2R) del clorhidrato de Milnaciprán (F2695). La expresión “enantiómero (1R,2S) del Milnaciprán” designa el enantiómero (1R,2S) del Milnaciprán, así como las sales farmacéuticamente aceptables de éste tales como el clorhidrato (F2696). La expresión “mezcla racémica” designa una mezcla 50:50 en peso de enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán y de enantiómero (1R,2S) del Milnaciprán, así como las sales farmacéuticamente aceptables de éstos.

30 Existen unos metabolitos, preferentemente los metabolitos activos in vivo del Milnaciprán, y sus sales farmacéuticamente aceptables, tales como:

• el clorhidrato del ácido Z-(±)fenil-1-aminometil-2-ciclopropan-carboxílico (F1567): 35

**(Ver fórmula)**

Masa molecular: 277,7 Características: cristales blancos 40 Punto de fusión: 230ºC Cromatografía de placa: soporte: sílice Disolvente: Butanol/etanol/agua (6/2/2) Revelación: Ultravioleta y ninhidrina Rf: 0,6 45 • el (±)fenil-3-metilen-2-4-pirrolidona-3 (F1612):

**(Ver fórmula)**

Masa molecular: 173,2

Características: cristales blancos Punto de fusión: 70ºC Cromatografía de placa: soporte: sílice

Disolvente: Benzeno/dioxano/etanol (90/25/4) Revelación: Ultravioleta y yodo Rf: 0,46

• el clorhidrato de Z(±)-(para-hidroxifenil)-1-dietilaminocarbonil-1-aminometil-2-ciclopropano (F2782):

**(Ver fórmula)**

Masa molecular: 298,82 Características: cristales blancos Punto de fusión: 250ºC

15 Cromatografía de placa: soporte: sílice Disolvente: Butanol/etanol/agua (6/2/2) Revelación: Ultravioleta y yodo -ninhidrina Rf: 0,42

20 • el oxalato ácido de Z(±)-fenil-1-etilamino-carbonil-1-aminometil-2-ciclopropano (F2800): Punto de fusión: 245ºC

**(Ver fórmula)**

25 30 Masa molecular: Características: Punto de fusión: Cromatografía de placa: 308,33 cristales blancos 150ºC soporte: sílice Disolvente: CHCl3/metanol/NH4OH (90/9/1) Revelación: Ultravioleta y ninhidrina Rf: 0,40 • el clorhidrato de Z(±)-fenil-1-aminocarbonil-1-aminometil-2-ciclopropano (F2941)

**(Ver fórmula)**

35 Masa molecular: 226,74 Características: cristales blancos

Cromatografía de placa: soporte: sílice

Disolvente: CHCl3/metanol/NH4OH (80/18/2)

Revelación: Ultravioleta y ninhidrina

Rf: 0,30

Al igual que el Milnaciprán, estos metabolitos presentan dos carbonos asimétricos que conducen a dos configuraciones espaciales diferentes (1S,2R) y (1R,2S). Siendo estas configuraciones espaciales no superponibles, estos metabolitos presentan asimismo una isomería óptica. El ratio de los dos enantiómeros del metabolito del Milnaciprán en la mezcla de enantiómeros es tal como se ha descrito anteriormente para los enantiómeros del Milnaciprán.

Mediante la expresión “metabolito activo” se entiende designar un derivado que procede de la metabolización in vitro

o in vivo y que presenta una aptitud para inhibir la recaptura de la serotonina y de la noradrenalina; se trata preferentemente del F2782, F2941, F2800, F1612 y F1567.

La expresión “sal farmacéuticamente aceptable” designa todas las sales que conservan la eficacia y las propiedades de un principio activo y que no presentan ningún efecto secundario. Preferentemente, se trata de sales de ácidos minerales u orgánicos farmacéuticamente aceptables. A título de ejemplos preferidos, pero no limitativos, se mencionarán los halogenohidratos, tales como el clorhidrato y el bromohidrato, el fumarato, el maleato, el oxalato, el citrato, el metansulfonato, el glutamato, el tartrato, el mesilato, y sus hidratos eventuales.

El enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, se administra a cualquier tipo de pacientes, tales como los definidos a continuación, que necesiten dicho tratamiento, ya sea con un objetivo terapéutico y/o profiláctico. En un objetivo terapéutico, se pretende la erradicación o la mejora de la afección a tratar y/o de uno o varios síntoma(s) asociado(s). En un objetivo profiláctico, se pretende la prevención de la aparición de la afección a tratar y/o de uno o varios síntoma(s) asociado(s). Sin embargo, el enantiómero según la invención se adapta a unas poblaciones de pacientes de riesgo que serían susceptibles de desarrollar ciertas manifestaciones clínicas indeseables a lo largo o tras un tratamiento mediante el Milnaciprán en forma racémica. Se trata de los pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares (por ejemplo el infarto de miocardio) y/o que padecen trastornos cardiovasculares, tales como unos pacientes que presentan unos trastornos del ritmo cardiaco (taquicardia, bradicardia, palpitaciones).

Entre las múltiples patologías o afecciones que presentan como síntoma unos trastornos del ritmo cardiaco y para las cuales la presente invención está particularmente adaptada al tratamiento de los pacientes de riesgo que las padecen, conviene citar más particularmente la taquicardia que corresponde a una aceleración del ritmo de los latidos cardiacos (la taquicardia es moderada cuando las pulsaciones son de 80 a 100 por minuto, intensa cuando sobrepasan 100), las palpitaciones, los extrasístoles (esporádicas, frecuentes o durante el infarto de miocardio), la fibrilación auricular, el flúter y la taquisistolia auricular, la bradicardia, la insuficiencia cardiaca, el infarto de miocardio.

Entre las múltiples patologías que presentan como síntomas unos trastornos de la presión arterial y para las cuales la presente invención está particularmente adaptada al tratamiento de los pacientes de riesgo que la padecen, conviene citar más particularmente: la hipertensión arterial, la hipertensión arterial maligna, la hipertensión arterial pulmonar, la hipertensión portal, la hipertensión paroxística esencial, la hipotensión, la hipotensión ortostática, la hipertensión intracraneal.

Ventajosamente, los trastornos cardiovasculares cuyos riesgos pueden ser limitados por la administración de la mezcla de enantiómeros según la invención, y preferentemente por la administración del enantiómero F2695 sustancialmente puro, son:

→ la elevación de la presión arterial diastólica y/o sistólica medida en milímetros de mercurio (mm de Hg); más particularmente, se trata del aumento de la presión cardiaca diastólica, y/o

→ unos trastornos del ritmo cardiaco, en particular un aumento de la frecuencia cardiaca en el paciente.

La presión arterial sistólica es el valor máximo de la presión arterial, y corresponde al momento en el que se escuchan los primeros latidos cardiacos a nivel de la arteria humeral durante la medición de la presión arterial. La sístole es el periodo de la revolución cardiaca durante la cual las cavidades del corazón se contraen, conllevando así la eyección de la sangre. La presión arterial diastólica es el valor mínimo de la presión arterial, que corresponde a la desaparición de los ruidos cardiacos a nivel de la arteria humeral cuando se deshincha el tonómetro durante la medición de la presión arterial. La diástole es el periodo de la revolución cardiaca durante la cual las cavidades del corazón se llenan de sangre. La elevación de la presión sistólica y/o diastólica implica la elevación de la tensión arterial que caracteriza la hipertensión arterial sistémica (y sus variantes) cuyos síntomas pueden ser los siguientes: dolores de cabeza, trastornos sensoriales ligeros tales como vértigos, zumbidos de oídos, palpitaciones, hemorragia de la nariz, confusión o somnolencia, calambres, entumecimientos u hormigueo en los pies y las manos. La hipertensión arterial sistémica (o sus variantes) puede conllevar a unas complicaciones graves, incluso a veces mortales: accidentes neurológicos de origen vascular, insuficiencia ventricular izquierda, insuficiencia renal, cardiopatías isquémicas (infarto de miocardio, angor y sus variantes). Según las recomendaciones actuales, se considera que un paciente padece de hipertensión arterial cuando la presión arterial es superior a 90 mm de Hg para la presión diastólica, y 140 mm de Hg para la presión sistólica.

La toxicidad cuyos riesgos se pueden limitar mediante la administración del enantiómero según la invención es ventajosamente la toxicidad orgánica, en particular la toxicidad cardiaca, y/o la toxicidad tisular, en particular la toxicidad hepática y/o renal. Esta toxicidad tisular puede ser revelada mediante la presencia de ictericias o mediante unos marcadores biológicos.

El uso del enantiómero según la invención en medicina veterinaria para el tratamiento de animales, en particular de animales domésticos o de criadero que necesitan dicho tratamiento está comprendido asimismo en el alcance de la presente invención.

Debido a sus propiedades farmacológicas, en particular de inhibidores dobles de la recaptura de la serotonina (5-HT) y de la noradrenalina (NA), el enantiómero según la invención es particularmente útil para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento preventivo y/o curativo de numerosas patologías o afecciones (síndrome) descritas a continuación, limitando al mismo tiempo los riesgos de trastornos cardiovasculares y/o limitando al mismo tiempo la toxicidad orgánica y/o tisular, en particular la toxicidad cardiaca hepática y/o renal.

Entre estas patologías o afecciones, conviene citar las patologías del sistema nervioso central tales como se definen en “The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders -IV (DSM-IV), 1995 American Psychiatric Association” A título de ejemplos ilustrativos y no limitativos, conviene citar, la depresión, en particular la depresión profunda, la depresión resistente, la depresión de la persona mayor, la depresión sicótica, la depresión inducida por unos tratamientos interferón, el estado depresivo, el síndrome maniaco-depresivo, los episodios depresivos estacionales, los episodios depresivos relacionados con una condición médica general, los episodios depresivos relacionados con unas sustancias que actúan sobre el humor, el síndrome bipolar, la esquizofrenia, la ansiedad generalizada, los estados de morosidad y de marasmo, las enfermedades relacionadas con el estrés, los ataques de pánico, la fobia, en particular la agorafobia, los trastornos obsesivo-compulsivos, los trastornos de la conducta, los trastornos oposicionales, los síndromes de estrés post-traumáticos, la depresión del sistema inmunitario, la fatiga y los síndromes de dolor que la acompañan, el síndrome de fatiga crónica, la fibromialgia, y otras patologías de naturaleza somática funcional, el autismo, las patologías caracterizadas por una ausencia de atención debidas a unas condiciones médicas generales, los trastornos de la atención debidos a hiperactividad, los trastornos de las conductas alimenticias, la neurosis bulímica, la neurosis anoréxica, la obesidad, los trastornos sicóticos, la apatía, la migraña, el dolor, y en particular el dolor crónico, el síndrome del colon irritable, las enfermedades cardiovasculares, y en particular el síndrome ansio-depresivo en el infarto de miocardio o en la hipertensión, las enfermedades neurodegenerativas y los síndromes ansio-depresivos asociados (enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson), las incontinencias urinarias, en particular la incontinencia urinaria relacionada con el estrés y la enuresis, la dependencia a las drogas, y en particular la ansio-dependencia al tabaco, en particular a la nicotina, al alcohol, a los estupefacientes, a las drogas, a los analgésicos durante la abstinencia de estos estados de dependencia.

Más particularmente, la presente invención tiene por objeto el uso del enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, para la preparación de un medicamento destinado a prevenir o tratar la depresión o el estado depresivo limitando al mismo tiempo los riesgos de trastornos cardiovasculares y/o limitando al mismo tiempo la toxicidad orgánica y/o tisular, en particular la toxicidad hepática y/o renal. En el ámbito de la presente invención, mediante el término “depresión” se entiende un conjunto de síntomas que comprenden por una parte un aspecto psíquico constituido por trastornos del humor con pesimismo, dolor moral, idea de muerte y de suicidio, inhibición psíquica, y por otra parte un aspecto físico de inhibición motora constituida en particular por una disminución motora, por trastornos del apetito, por estreñimiento, por trastornos del sueño y por la regulación del peso. La depresión corresponde por lo tanto a un estado psíquico patológico que asocia una modificación grave del humor y una disminución de la actividad intelectual y motora. Mediante la expresión “estado depresivo” se entiende un estado mental caracterizado por un aflojamiento del tono neuro-psíquico, que se manifiesta mediante la lasitud, el cansancio, el desánimo y la tendencia al pesimismo, y que se acompaña a veces de ansiedad.

Asimismo, la presente invención tiene más particularmente por objeto el uso del enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, para la preparación de un medicamento destinado a prevenir o tratar la fibromialgia y/o el síndrome de fatiga crónica limitando al mismo tiempo los riesgos de trastornos cardiovasculares y/o limitando al mismo tiempo la toxicidad orgánica y/o tisular, en particular la toxicidad hepática y/o renal. El síndrome de fibromialgia es un síndrome crónico caracterizado por una sensación de dolor o de quemadura con rigidización matinal que afecta principalmente a los tejidos fibrosos articulares y periarticulares, y por un sentimiento de fatiga profunda. La fibromialgia comprende un conjunto de síntomas. Los más frecuentes son un descanso no reparador, dolores de cabeza, trastornos digestivos, un estado depresivo, unos espasmos musculares, unos dolores en la cara, unas entumecimientos, etc. El síndrome de fatiga crónica se caracteriza por un estado de agotamiento o de fatiga. Los síntomas más corrientes son un estado de debilidad, unos espasmos y/o unos dolores musculares, una necesidad de descanso excesiva, fiebre, angina, pérdidas de memoria y/o problemas de concentración, insomnios, depresión.

Asimismo, la presente invención tiene más particularmente por objeto el uso del enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, para la preparación de un medicamento destinado a prevenir o tratar el dolor, y en particular el dolor crónico, limitando al mismo tiempo los riesgos de trastornos cardiovasculares y/o limitando al mismo tiempo la toxicidad orgánica y/o tisular, en particular la toxicidad hepática y/o renal. El dolor se puede asociar a diferentes patologías y/o heridas. Puede ser agudo o crónico. Unos estudios epidemiológicos han demostrado las relaciones existentes entre unos estados de dolores crónicos y las ansiodepresiones. Así, unos pacientes que sufren de dolor crónico pueden desarrollar unos problemas emocionales que conducen a una depresión, y, en el peor de los casos, a un intento de suicidio. Se considera que un paciente padece dolores crónicos si se queja de sufrir desde un periodo que excede los seis meses. Entre los dolores crónicos, convienen citar a título de ejemplo ilustrativo y no limitativo, los dolores asociados con la fibromialgia y/o que proceden de tejidos fibrosos, de los músculos, de los tendones, de los ligamentos y de otros sitios, los dolores abdominales y las diarreas en el síndrome del colon irritable, y asimismo los dolores de la parte baja de la espalda.

Asimismo, la presente invención tiene más particularmente por objeto el uso del enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, para la preparación de un medicamento destinado a prevenir o tratar las incontinencias urinarias, en particular la incontinencia urinaria relacionada con el estrés y la enuresis, limitando al mismo tiempo los riesgos de trastornos cardiovasculares y/o limitando al mismo tiempo la toxicidad orgánica y/o tisular, en particular la toxicidad hepática y/o renal.

El tratamiento profiláctico y terapéutico de las patologías anteriores se realiza suministrando a un animal, preferentemente el ser humano, una cantidad terapéuticamente eficaz del enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, solo o en asociación con por lo menos otro principio activo. En la mayoría de los casos, se trata del ser humano, pero el tratamiento se adapta asimismo a los animales, en particular a los animales de criadero (ganado, roedores, aves de corral, peces, etc.) y a los animales de compañía (perros, gatos, conejos, caballos, etc.).

El enantiómero (1S,1R) del Milnaciprán, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, tal como se ha descrito anteriormente, se administra ventajosamente a unos pacientes que reciben simultánea, separadamente o de manera espaciada en el tiempo, por lo menos un segundo compuesto activo en el tratamiento de las patologías citadas anteriormente.

De manera preferida, la presente invención tiene asimismo por objeto el uso como medicamento:

a) de dicho enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, y

b) de por lo menos un compuesto activo seleccionado de entre los psicótropos, en particular los antidepresivos, y los agentes anti-muscarínicos,

como productos de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo para el tratamiento o la prevención de la depresión, en particular la depresión profunda, la depresión resistente, la depresión de la persona mayor, la depresión psicótica, la depresión inducida por unos tratamientos interferón, el estado depresivo, el síndrome maniaco-depresivo, los episodios depresivos estacionales, los episodios depresivos relacionados con una condición médica general, los episodios depresivos relacionados con unas sustancias que actúan sobre el humor.

Por el término “sicotrópico” se entiende designar una sustancia de origen natural o artificial capaz de modificar la actividad mental, y cuya acción esencial se ejerce sobre el sistema nervioso central y el psiquismo. Los psicótropos se dividen en tres grupos: 1) los psicolépticos (hipnóticos, neurolépticos y ansiolíticos), 2) los psicoanalépticos (antidepresivos y psicotónicos) y 3) los psicodislépticos (alucinógenos).

Preferentemente, dicho sicótropo es un antidepresivo. A título de ejemplo no limitativo, el antidepresivo se selecciona de entre (i) los inhibidores de la mono-amina-oxidasa (IMAO) tales como la iproniazida, la pargilina, la selegina, (ii) los agonistas 5HT1D tales como el sumatriptán, la adrenalina y la noradrenalina (simpato-miméticos alfa y beta), (iii) los antidepresivos tricíclicos, tales como la imipramina, la clomipramina, (iv) los inhibidores selectivos de la recaptura de la serotonina (SSRI) tal como la fluoxetina, (v) los inhibidores selectivos de la recaptura de la norepinefrina tales como, por ejemplo, la tandamina, el fluparoxán, la mirtazapina, (vi) los inhibidores de la recaptura de la serotonina y de la norepinefrina, tales como la venlafaxina y la duloxetina. A título de ejemplo no limitativo, el agente anti-muscarínico se selecciona de entre la tolterodina, la propiverina, la oxibutinina, el trospio, la darifenacina, la temiverina, el ipratropio.

Preferentemente, la presente invención tiene asimismo por objeto el uso como medicamento:

a) de dicho enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, y

b) de por lo menos otro principio activo seleccionado de entre los compuestos activos que inducen una toxicidad orgánica y los compuestos activos que inducen una toxicidad tisular, en particular hepática y/o renal, o con uno o varios principios activos destinados al tratamiento de la insuficiencia hepática y/o renal,

como productos de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo para el tratamiento o la prevención de las afecciones o patologías que se pueden curar mediante la inhibición doble de la recaptura de la serotonina (5-HT) y de la noradrenalina (NA).

De manera preferida, la presente invención tiene asimismo por objeto el uso como medicamento:

a) de dicho enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán, así como sus sales farmacéuticamente aceptables, y

b) de por lo menos otro principio activo seleccionado de entre los compuestos activos que inducen unos efectos secundarios cardiovasculares y los compuestos con diana cardiaca,

como productos de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo para el tratamiento o la prevención de las afecciones o patologías que se pueden curar mediante la inhibición doble de la recaptura de la serotonina (5-HT) y de la noradrenalina (NA).

Ventajosamente, los efectos secundarios cardiovasculares inducidos son los indicados anteriormente, y más particularmente una hipertensión arterial, una hipotensión, unos trastornos del ritmo cardiaco (taquicardia, bradicardia, palpitaciones).

La presente invención tiene asimismo por objeto las composiciones farmacéuticas que contienen los productos de combinación descritos anteriormente.

En el ámbito de la presente invención, el enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, se administra ventajosamente, de manera no limitativa, por vía oral, vía nasal, transdérmica, rectal, intestinal, parenteral, por inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa, solo o en combinación con otros principios activos, tal como se ha descrito anteriormente,

Cuando se administra solo, el enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, se puede administrar per se o en forma de una composición farmacéutica en la que dicho enantiómero o sus sales farmacéuticamente aceptables, está en asociación o en mezcla con uno o varios soportes, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, que facilitan la biodisponibilidad.

Cuando el enantiómero según la invención, y preferentemente el enantiómero (1S,R2) F2695 del Milnaciprán sustancialmente puro, se administra en asociación con otros principios activos, dicho enantiómero y los demás principios activos se pueden formular en mezcla o aparte en forma idéntica o diferente. Se pueden administrar por la misma vía o una vía diferente.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden formular de maneras habituales bien conocidas por el experto en la materia, usando uno o varios soportes fisiológicamente aceptables que comprenden unos excipientes, adyuvantes y unos auxiliares tales como, por ejemplo, unos agentes conservantes, unos agentes estabilizantes, unos agentes humectantes o emulsionantes. El método de formulación seleccionado depende de la vía de administración deseada.

En el caso de una administración por inyección, se usa ventajosamente una disolución acuosa, en particular una disolución tampón fisiológicamente aceptable, tal como una disolución de Hank, una disolución de Ringer o una disolución tampón de salina fisiológica. En el caso de una administración transdérmica o a nivel de las mucosas, se usan ventajosamente unos agentes penetrantes apropiados para la mucosa a atravesar. Dichos agentes penetrantes son bien conocidos por el experto en la materia. En el caso de una administración oral, las composiciones farmacéuticas según la invención se administran ventajosamente en formas unitarias o multidosis de administración en mezcla con unos soportes farmacéuticos adecuados conocidos por el experto en la materia. Las formas unitarias de administración apropiadas comprenden en particular los comprimidos eventualmente divisibles, las cápsulas blandas, los polvos, los granulados y las disoluciones o suspensiones orales, los aerosoles. Las formas multidosis de administración apropiadas comprenden en particular las gotas bebibles, las emulsiones y los jarabes.

Durante la preparación de comprimidos, el enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, se formula con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como en particular la polivinilpirrolidona, el gel carbopol, el polietilenglicol, la gelatina, el talco, el almidón, la lactosa, el estearato de magnesio, la goma arábiga, o sus análogos. A título de ejemplo, el comprimido contiene los siguientes excipientes: hidrogenofosfato de calcio deshidratado, carmelosa cálcica, povidona K30, sílice coloidal anhidra, estearato de magnesio, talco. Los comprimidos pueden estar eventualmente revestidos, es decir recubiertos de varias capas de sustancias diversas tales como sacarosa, a fin de facilitar la toma o la conservación. El revestimiento puede asimismo contener unos pigmentos o unos colorantes a fin de distinguir y caracterizar los comprimidos en función de su dosificación, por ejemplo. Los comprimidos pueden presentar asimismo una formulación más o menos compleja destinada a modificar la velocidad de liberación del principio activo. La liberación del principio activo de dicho comprimido se puede acelerar, ralentizar o retrasar en función de la absorción deseada. El enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, se puede preparar así en una forma galénica de liberación prolongada obtenida según el procedimiento descrito en la patente EP 939 626. Esta forma galénica se presenta en forma multiparticular que reúne una pluralidad de minigránulos y presenta un cierto perfil de liberación in vitro.

La liberación del enantiómero según la invención se puede retrasar y/o controlar a través del uso de un implante o a través de una liberación transcutánea, en particular subcutánea o intramuscular, a través de una inyección intramuscular o a través de un parche transdérmico. Dicho enantiómero se formula entonces en particular con unas sustancias hidrófobas o poliméricas adecuadas y unas resinas intercambiadoras de iones.

La cantidad a administrar al paciente del enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, depende de las afecciones a tratar, del efecto deseado, en particular un efecto terapéutico o profiláctico, del estado de salud y de la edad del paciente, en particular de sus antecedentes cardiovasculares, de las condiciones de tratamiento y del modo de administración del medicamento. Las cantidades eficaces terapéuticas

o profilácticas a administrar a un paciente humano se pueden determinar a partir de modelos animales o de unos datos, conocidos por el experto en la materia, durante el tratamiento de la depresión en el ser humano, por ejemplo mediante el uso de dicho enantiómero de Milnaciprán.

En el ámbito del tratamiento profiláctico y/o terapéutico de las patologías citadas anteriormente, y en particular de la depresión, de los estados depresivos, de la fibromialgia, del síndrome de la fatiga crónica, del dolor, el medicamento según la invención se administra ventajosamente a unas dosis comprendidas entre 0,01 mg y 10 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas, todavía más ventajosamente a unas dosis comprendidas entre 0,05 mg y 5 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas, todavía más ventajosamente a unas dosis comprendidas entre 0,1 mg y 1 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas. De manera particularmente ventajosa, la administración de dicho medicamento a unas dosis tales como se han definido anteriormente, se reparte en dos tomas diarias, preferentemente en forma de cápsulas blandas. A título de ejemplo, el enantiómero según la invención, preferentemente el enantiómero F2695 sustancialmente puro, se administra en forma de cápsula blanda cuyo contenido en principio activo es ventajosamente de aproximadamente 6,75 mg/cápsula blanda, 12,5 mg/cápsula blanda, 25 mg/cápsula blanda, 50 mg/cápsula blanda.

Otras características, objetivos y ventajas de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos siguientes. La invención no está limitada a los ejemplos particulares mencionados a simple título ilustrativo y que se deben leer con referencia a las figuras siguientes:

Leyenda de las figuras

Figura 1: Evolución de la frecuencia cardiaca después de una única administración (valores de deltas).

*** p ≤ 0,001 frente a agua desionizada ** p ≤ 0,01 frente a agua desionizada

*p ≤ 0,05 frente a agua desionizada

▲ p ≤ 0,05 frente a F2207

Figura 2: Evolución de la frecuencia cardiaca después de una única administración (valores absolutas).

*** p ≤ 0,001 frente a agua desionizada ** p ≤ 0,01 frente a agua desionizada

*p ≤ 0,05 frente a agua desionizada

▲ p ≤ 0,05 frente a F2207

Figura 3: Efectos de los diversos tratamientos sobre los valores medios de presiones arteriales diastólicas (medias de las 6 horas tras el último tratamiento, después de 5 días de tratamiento consecutivos).

Figura 4: Efectos de los diversos tratamientos sobre los valores medios de presiones arteriales sistólicas (medias de las 6 horas tras el último tratamiento, después de 5 días de tratamiento consecutivos).

Figura 5: Representación esquemática del modo de calculo del índice de toxicidad. El índice de toxicidad es la suma de todos los genes aumentados y disminuidos (en función del factor de inducción definido por el usuario).

Figuras 6a, 6b, 6c: Ensayo con el MTT sobre unos hepatocitos primarios de ratas. Las concentraciones se expresan en µM.

Ejemplos Ejemplo nº 1: Estudios farmacocinéticos del Milnaciprán y de sus enantiómeros

5 Se han realizado unos estudios farmacocinéticos del clorhidrato de Milnaciprán (F2207) y de sus enantiómeros (F2695 y F2696) en diferentes especies animales y en el ser humano.

En el animal, se ha estudiado la farmacocinética de cada enantiómero tras la administración del racemato o de un 10 solo enantiómero. Los índices plasmáticos de los enantiómeros F2695 y F2696 son aproximadamente equivalentes en las especies ensayadas (mono y rata).

Se ha realizado un estudio farmacocinético en el ser humano que comprende 12 sujetos sanos administrándoles el racemato o uno sólo de los dos enantiómeros. Se desprende que el perfil farmacocinético de cada enantiómero es 15 independiente debido a que han sido administrados separadamente o bien en forma de racemato, lo que indica la ausencia de interacciones entre los dos enantiómeros (Tabla 1).

TABLA 1: Tabla de las principales variables farmacocinéticas del clorhidrato de Milnaciprán (F2207) y de sus dos enantiómeros F2695 y F2696.

20 Cmax: concentración plasmática máxima estimada directamente a partir de los datos experimentales. Tmax: Tiempo de obtención de la concentración plasmática máxima. 25 Auc0→∞: Área bajo la curva de las concentraciones plasmáticas en función del tiempo extrapolado al infinito. T: Semivida Terminal de decrecimiento de las concentraciones plasmáticas.

Dosis administrada (mg) F2207 (50 mg) F2695 (D) (25 mg) F2696 (L) (25 mg) F2695 (D) F2696 (L) Cmax (nmol.l-1) 214 179 216 212 Tmax (hora) 3,42 2,87 3,08 2,21 AUC 0→∞ (nmol.h.l-1) 2896 1563 2869 1543 T (horas) 9,28 5,75 9,38 5,58

30 Estos resultados indican que no se ha observado ninguna bioconversión de los enantiómeros F2695 y F2696 en las especies analizadas.

Ejemplo 2: Estudios bioquímicos del Milnaciprán y de sus enantiómeros Se han estudiado los dos enantiómeros (F2695 y F2696) del clorhidrato de Milnaciprán (F2207) in vitro sobre las capturas de noradrenalina y serotonina así como sobre el enlace (“binding”) de la paroxetina a nivel del cerebro de la rata.

2.1. Materiales y métodos

40

2.1.1. Captura de noradrenalina mediante un homogenado (P2) de hipotálamo de rata.

Preparación del P2

45 Se matan y se decapitan unas ratas macho, Sprague-Dawley, de 200 a 300 g, y después se extrae rápidamente el hipotálamo. Se homogeneizan dos hipotálamos en 4 ml de sacarosa 0,32 M con un Potter S mediante 16 idas y vueltas completas a 800 rpm, y después se centrifugan durante 10 minutos a 1.000 g para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se centrifuga durante 20 minutos a 10.000 g y el P2 así obtenido se recoge en 4 ml de sacarosa 0,32 M y se homogeneiza con un Dounce.

50 Captura (“absorción”)

Se usa 3H-(1)-NA:13 Ci/mmoles (Amersham).

55 La absorción se realiza en un tampón de fosfato (que contiene por litro: 8 g de NaCl, 1,21 g de K2HPO4 y 0,34 g de KH2PO4) preoxigenado durante 30 minutos antes del uso mediante una mezcla O2/CO2 (95%/5%).

En unos tubos de plástico de 5 ml dispuestos en baño maría a 37ºC se introducen:

- 100 µl de tampón inhibidor,

- 700 µl de tampón (que contiene pargilina 25 µM),

- 100 µl de P2.

Después del equilibrado de la temperatura, la reacción comienza mediante la adición de 100 µl de 3H-NA, 50 nM al final.

La reacción se detiene exactamente 10 minutos después, mediante adición de 2,5 ml de tampón helado y filtración sobre filtros GF/F. Después, el tubo se aclara una vez y el filtro una vez con 2,5 ml de tampón helado. Después, se introduce el filtro es un minifrasco Beckman, y después de la adición de 3 ml de líquido de centelleo Instagel (Packard), se mide la radioactividad en un contador de centelleo líquido Tricarb Packard.

La absorción no específica (NS) se mide en presencia de DMI 10-5 M.

El porcentaje de inhibición se calcula mediante la fórmula:

(absorción total -NS) -(absorción en presencia de inhibidor -NS) (absorción total -NS)

El IC50 se determina gráficamente sobre la curva media de los porcentajes de inhibición (4 ensayos) en función del log de la concentración en inhibidor.

2.1.2. Captura de serotonina

El método se ha realizado según Gray y Whittaker (1962, J. Anat., 96: 79-97). Después de la homogeneización del tejido cerebral en una disolución de sacarosa, las terminaciones presinápticas se sueltan del axón y se vuelven a cerrar para formar unos sinaptosomas obtenidos mediante fraccionamiento subcelular.

Se han usado unas ratas macho Sprague-Dawley (Janvier) de 180-200 g. Después del sacrificio del animal, se extrae el hipotálamo, se pesa, se homogeneiza con un Dounce en sacarosa 0,32 M a 0ºC.

Este homogenado se ha centrifugado durante 10 minutos a 1.000 g (2.400 rpm. -Hettich, Rotenta). Se ha recuperado el sobrenadante y se ha centrifugado durante 20 minutos a 10.000 g (8.000 rpm. -Beckam, modelo J221 M: rotor J14). El residuo (denominado fracción P2) se recogió en sacarosa con una concentración de 50 mg/ml.

Se ha incubado durante 5 minutos a 37ºC:

• 350 µl de tampón helado (NaCl 136 mM, KH2PO4 2,4mM, K2HPO4 6,9 mM, pH 7,2) preoxigenado 30 minutos antes,

• 50 µl de membranas (5 mg/ml final),

• 50 µl de citalopram (10-5 M final) para la captura no específica,

• 50 µl de 3H-5-HT (50 nM final) (NEN, Francia, 28,4 Ci/mmol).

Exactamente 5 minutos después del comienzo de la incubación, se ha detenido la reacción mediante filtración al vacío sobre filtros Whatman GF/F (predilución con 2,5 ml de tampón helado, y después aclarado con 3 veces 2,5 ml).

Se ha medido la radioactividad recogida sobre el filtro (Packard Tricarb 4640) mediante centelleo líquido con Emulsifier-Safe (Packard).

Los IC50 se han determinado llevando gráficamente los porcentajes de inhibición en función del log de la concentración en producto (6 concentraciones por duplicado).

2.1.3. Enlace (“binding”) de la paroxetina

Se han usado unas ratas macho Sprague-Dawley (Janvier) de 180-200 g. Se han reunido los hipotálamos de varias ratas y se han homogeneizado en 5 ml de tampón helado (50 mM de Tris-HCL, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, pH 7,5) con el Dounce, y el homogenado se centrifugó a 30.000 g (27.000 rpm. -Beckman, L5-50E, rotor T40) durante 10 minutos. El residuo obtenido se recogió en 5 ml de tampón y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones. El nuevo residuo se recogió en el mismo tampón y, por último, se rehomogeneizó con el Dounce con una concentración tisular de 10 mg/ml. Se ha incubado la suspensión membranaria (100 µl) con la 3H-paroxetina (NEN, Francia, 28,6 Ci/mmol) con la concentración (final) de 0,1 nM, a 20ºC, en un volumen final de 1 ml durante 2 horas. Al cabo de las 2 horas de incubación, se ha detenido la reacción mediante filtración al vacío sobre filtros Whatman GF/F pretratados en una disolución de polietilenimina al 0,05% 30 minutos antes (predilución con 4 ml de tampón helado y después aclarado del tubo con 2 veces 4 ml). Se ha medido la radioactividad mediante espectrometría de

5 centelleo líquido (Packard, Tricarb 4640) usando el Emulsifier-Safe (Packard) como agente de centelleo.

El enlace específico de la 3H-paroxetina se ha definido como la diferencia entre el enlace total y el que permanece en presencia de 10 µM de fluoxetina.

Se han determinado los IC50 llevando gráficamente los porcentajes de inhibición en función del log de la concentración en producto (6 concentraciones por duplicado).

2.1.4. Productos usados

15 F2207: lote nº 10-CTN3 clave P118 F2695: lote nº PL-I-205 F2696: lote nº PL-I-204C.

2.2. Resultados

Los efectos del F2207 y de sus dos enantiómeros sobre la captura de noradrenalina y serotonina y sobre el enlace de la paroxetina se representan en un gráfico con en ordenadas el porcentaje de inhibición en función (%) y en abscisas la concentración (M) del F2207, F2695 o del F2696 (datos no mostrados). Los valores de los porcentajes de inhibición que corresponden a cada concentración de producto, ensayada por duplicado, son las medias de los

25 resultados de cuatro experimentos independientes.

Los valores de los IC50 de los tres productos se han determinado a partir de sus curvas y figuran en la tabla 2.

TABLA 2: Inhibición de las capturas de 3H-noradrenalina, 3H-serotonina y enlace (binding) de la 3Hparoxetina.

IC50 (M) Compuestos Captura Enlace (binding)3H-paroxetina 3H-noradrenalina 3H-serotonina F2695 1,5 X 10-8 4,6 X 10-8 6,0 X 10-8 F2207 3,0 X 10-8 15 X 10-8 13 X 10-8 F2696 75 X 10-8 60 X 10-8 70 X 10-8

Los tres compuestos son activos en estos tres ensayos farmacológicos, pero existen unas diferencias: 35 -en la captura de noradrenalina: El F2695 es 2 veces más activo que el F2207. El F2695 es 25 veces más activo que el F2695. -en la captura de serotonina: El F2695 es 3 veces más activo que el F2207. El F2695 es 12 veces más activo que el F2696. 45 -en el enlace (binding) de la paroxetina: El F2695 es 2 veces más activo que el F2207. El F2695 es 10 veces más activo que el F2696. Los tres compuestos son activos en estos ensayos farmacológicos, sin embargo con una actividad menor para la forma (1R,2S) (F2696) y el racemato (F2207). La forma (1S,2R) del clorhidrato de Milnaciprán (F2695) es 2 a 3 veces más activa que el F2207.

Ejemplo nº 3

Actividad comparativa por vía oral del clorhidrato de Milnaciprán racémico (F2207) y de su enantiómero (1S,2R) activo (F2695) sobre la frecuencia cardiaca y la presión arterial en el perro vigilante.

3.1. Introducción

Este estudio propone estudiar los efectos del F2207 y del F2695 a) en administración única por vía oral sobre la frecuencia cardiaca (n = 28 perros), y b) después del tratamiento reiterado de 5 días por vía oral sobre las presiones arteriales sistólica y diastólica en el perro (n = 6 perros).

Se ha realizado este estudio con dosis equivalentes farmacológicamente activas de F2207 y F2695 sobre unos animales hembras equipados con implantes (Data Sciences International) que permiten la adquisición de la frecuencia cardiaca y de los parámetros tensionales por telemetría. Estos animales se han repartido para todos los estudios en 3 grupos de tratamiento:

- grupo 1 (control) tratado con agua desionizada, -grupo 2 tratado con F2207 con la dosis de 20 mg/kg/D, -grupo 3 tratado con F2695 con la dosis de 10 mg/kg/D,

3.2. Metodología

Debido al bajo número de animales simultáneamente equipados (máximo 8), del número de pistas de registro del equipo usado (8 pistas), y de manera que constituyen unos grupos de tratamiento homogéneos, la evaluación global se ha realizado en cuatro estudios, siendo cada estudio fraccionado en tres etapas (tratamiento de cada animal con cada uno de los tres productos), separadas por un periodo de lavado y de reinicialización de sondas (“wash-out”). Cada etapa en sí se desarrolla en dos fases:

- una primera fase durante la cual todos los animales se tratan con agua desionizada para acostumbrarles a 30 la contención y al tratamiento oral mediante sonda de cebado,

- una segunda fase durante la cual los animales reciben su tratamiento respectivo (administración única para la frecuencia cardiaca, estudios nº 894/926/935/936; administración reiterada cinco días para la presión arterial, estudio nº 894).

35 El esquema experimental global se describe en la tabla siguiente:

TABLA 3: Esquema experimental global para el estudio mediante telemetría de los efectos del clorhidrato de Milnaciprán racémico (F2207) y de su enantiómero (1S,2R) activo F2695 administrados oralmente en el perro consciente.

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GRUPOnº 1 2 3

ANIMALES Número 27 28 28 Identificación 1-2-7-8-13-14 3-4-9-10-15-16 5-6-11-12-17-18 (estudio 894) (estudio 894) (estudio 894) 1-2-7-8-13-14 3-4-9-10-15-16 5-6-11-12-17-18 (estudio 926) (estudio 926) (estudio 926) 1-2-9–10 3-4-5–12 6-7-8–14

11-17-18-19 13-20-21-22 15-16-23-24 (estudio 935) (estudio 935) (estudio 935) 1-2-9-10 3-4-5–12 6-7-8–14 11-17-18-19 13-20-21-22 15-16-23-24

(estudio 936) (estudio 936) (estudio 936) TRATAMIENTO Identificación Agua desionizada F2207 F2695 Dosis -20 mg/kg 10 mg/kg Vía ................................................................oral............................................................... Volumen ............................................................. 5 ml/kg ............................................................

(n = 27 en el grupo de control, al no haber sido registrada la señal de la sonda del animal n º 18

Se han analizado los efectos de los diferentes tratamientos sobre la frecuencia cardiaca en los cuatro estudios, 45 después de la única administración. El análisis se refirió a los 13 tiempos de adquisición siguientes:

- antes del tratamiento único, -cada 30 minutos tras las 6 horas después del tratamiento único.

Se han analizado los efectos de los diferentes tratamientos sobre la presión arterial, en el estudio nº 894 en el estado de equilibrio, el D5, D29 y D33 (último día de tratamiento efectivo para cada unas de las etapas). El análisis se refirió a los tiempos de adquisición siguientes:

- antes del tratamiento,

- cada 30 minutos tras las 6 horas después del tratamiento.

3.3. Resultados

3.3.1. En lo que se refiere a la frecuencia cardiaca (cuatro estudios conjuntos), se ha realizado un ensayo de Tukey sobre los deltas de frecuencia individuales, para cada uno de los 12 tiempos experimentales post-tratamiento, frente al valor pre-tratamiento, así como sobre los valores absolutos de frecuencia cardiaca en cada tiempo de registro.

Así, se han objetivado, con relación a los animales de control que reciben el agua desionizada:

# cuando el análisis estadístico se realiza sobre los valores de deltas (figura 1):

- un aumento significativo de la frecuencia cardiaca a partir de la primera hora después de la administración única de F2207 (20 mg/kg), aumento que persiste hasta 5,5 horas después del tratamiento (p ≤ 0,001 para el conjunto de los tiempos de adquisición, con la excepción de los tiempos 0,5 y 5,5 horas, p ≤ 0,01, y del tiempo 5,0 horas, p ≤ 0,05, después del tratamiento),

- un aumento de la frecuencia cardiaca después de la administración del F2695 que sigue siendo todavía inferior a la obtenida después de la administración de F2207. Además, esta diferencia entre los efectos del F2207 y del F2695 es significativa (p < 0,05) 1 y 4 horas después de la administración a favor del F2695.

- un aumento de la frecuencia cardiaca que tarda menos tiempo con F2695 (1,0 a 4,5 horas) que con F2207 (persiste hasta 5,5 horas después del tratamiento).

# cuando el análisis estadístico se realiza sobre unos valores absolutos de frecuencia cardiaca, este mismo estudio demuestra (figura 2):

- un aumento significativo de la frecuencia cardiaca a partir de la primera hora después de la administración única de F2207 (20 mg/kg), aumento que persiste hasta 5,5 horas después del tratamiento (p ≤ 0,001 para el conjunto de los tiempos de adquisición de 1,0 a 4,5 horas, con la excepción del tiempo 3,5 horas, p ≤ 0,01; y p ≤ 0,01 para el tiempo de adquisición 5,5 horas después del tratamiento),

- un aumento de la frecuencia cardiaca después de la administración del F2695 que sigue siendo todavía inferior a la obtenida después de la administración de F2207. Además, esta diferencia entre los efectos del F2207 y del F2695 es significativa (p < 0,05) 1 y 4 horas después de la administración a favor del F2695.

- Un aumento de la frecuencia cardiaca que tarda menos tiempo con F2695 (1,0 a 4,5 horas) que con F2207 (que persiste hasta 5,5 horas después del tratamiento).

3.3.2. En lo que se refiere a la presión arterial (un estudio en administración reiterada), se ha calculado un valor medio de presión arterial diastólico (figura 3 y tabla 4), así como un valor medio de presión arterial sistólico (figura 3 y tabla 4) para cada perro y para las 6 horas tras el último tratamiento, después de 5 días consecutivos de administración. Se han analizado estos valores de presiones mediante ANOVA seguido de un ensayo de Tukey cuando ésta lo permitía (datos no mostrados).

Así, se han objetivado:

- un aumento significativo (p ≤ 0,001) de la presión arterial diastólica después de la administración reiterada durante 5 días de F2207 (20 mg/kg/D) o de F2695 (10 mg/kg/D) en comparación con el tratamiento con agua desionizada,

- una diferencia significativa (p ≤ 0,05) del valor de presión arterial diastólica mediada después de la administración reiterada durante 5 días de F2207 (20 mg/kg/D) en comparación con el valor mediado de la presión arterial diastólica después de la administración reiterada de F2695 (10 mg/kg/D),

- ningún efecto significativo a nivel de la presión arterial sistólica; sin embargo, se puede observar que los valores PAS después de la administración reiterada durante 5 días de F2695 son próximos a los valores de PAS después del tratamiento con agua desionizada.

Los datos individuales de presiones arteriales diastólica y sistólica se representan en las tablas 4 y 5 respectivamente.

TABLA 4: Datos individuales de presión arterial diastólicaPRESIÓN ARTERIAL DIASTÓLICA (PAD expresada en mm Hg)

Datos individuales después de la administración reiterada durante 5 días consecutivos

Grupo 1 2 3 Tratamiento VEHÍCULO F2207 (20 mg/kg/D) F2695 (10 mg/kg/D)Animal nº 1 2 7 8 13 14 Med. e.s.m. 3 4 9 10 15 16 Med. e.s.m. 5 6 11 12 17 18 Med. e.s.m. Tiempo antes deltratamiento 79 84 82 102 83 85 91 83 81 82 97 94 83 77 76 84 81 75 75 95 72 79 76 79 80 74 73 70 77 79 71 75 99 78 75 91 67 70 82 77 101 63 80 72 72 75 82 98 77 84 85 85 79 73 77 77 82 84 113 95 81 ND 85 82 78 76 70 76 68 75 79 84 65 68 85 82 82 77 81 4 74 3 77 2 81 5 80 4 81 2 89 3 75 3 77 2 89 5 84 5 82 4 79 1 112 103 130 131 123 137 121 120 133 135 116 103 115 89 106 117 127 113 111 118 106 114 110 120 107 133 93 96 113 137 99 116 112 133 105 126 98 115 120 88 86 92 88 113 90 96 100 88 107 101 115 116 106 116 103 111 110 109 104 97 97 106 92 104 103 91 87 106 91 109 107 92 103 103 108 105 93 104 93 4 95 3 112 5 114 8 107 5 115 5 111 4 114 5 113 4 115 5 106 4 103 4 113 5 73 91 112 109 115 111 104 96 125 103 126 88 101 89 91 96 83 88 88 91 106 91 104 100 86 113 80 99 75 88 93 97 96 94 99 92 92 105 98 71 76 90 108 97 87 97 87 95 84 89 92 96 100 107 77 108 80 100 85 95 110 98 89 105 109 78 85 96 112 109 107 106 103 109 108 102 99 108 78 3 94 3 94 5 96 5 97 5 97 4 99 2 97 5 102 6 99 3 104 5 94 3 106 2 Tiempo después deltratamiento (h)0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 PAD media después deltratamiento 87 79 78 81 83 76 81 2 122 115 114 104 101 101 110 4 107 95 94 98 92 104 98 2

ND: no determinado

TABLA 5: Datos individuales de presión arterial sistólicaPRESIÓN ARTERIAL SISTÓLICA (PAD expresada en mm Hg)Datos individuales después de la administración reiterada durante 5 días consecutivos

Grupo 1 2 3 Tratamiento VEHÍCULO F2207 (20 mg/kg/D) F2695 (10 mg/kg/D)Animal nº 1 2 7 8 13 14 Med. e.s.m. 3 4 9 10 15 16 Med. e.s.m. 5 6 11 12 17 18 Med. e.s.m. Tiempo antes deltratamiento 139 135 134 158 138 142 149 135 142 137 150 153 146 141 132 158 151 136 143 167 129 143 140 146 149 144 120 119 129 145 145 145 162 149 149 159 127 132 151 157 172 131 149 144 141 150 153 173 151 159 160 163 150 154 153 166 164 170 190 177 160 ND 148 176 146 138 138 143 137 144 148 154 137 144 152 145 144 143 145 7 134 4 142 4 149 3 148 5 150 3 158 3 143 4 151 4 158 8 151 7 145 4 151 5 188 158 180 186 171 195 173 165 180 184 161 151 158 164 154 167 181 160 168 177 153 157 161 171 154 192 176 152 157 189 146 168 164 184 151 180 146 173 171 149 130 128 126 150 126 129 136 122 140 144 153 157 141 167 139 154 150 155 145 141 139 152 132 154 148 169 129 130 138 163 161 146 155 153 168 166 155 172 163 8 141 6 152 9 160 12 150 7 165 7 160 6 161 6 158• 5 166 6 154 6 153 5 166 7 136 135 159 164 168 165 156 146 180 158 182 142 156 141 129 135 119 125 124 131 147 132 151 144 127 170 138 140 124 138 135 142 145 141 145 138 137 152 148 130 134 135 160 148 131 158 127 141 127 141 134 144 151 169 123 160 124 163 131 150 162 153 141 159 160 149 139 143 156 156 154 157 156 164 163 158 153 166 138 3 140 4 140 5 144 8 142 7 143 6 147 4 147 6 151 9 151 5 156 6 145 4 160 3 Tiempo después deltratamiento (h)0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 PAD media después deltratamiento 143 145 143 160 155 144 148 3 172 166 165 146 140 153 157 5 159 136 140 152 139 155 147 4

ND: no determinado

3.4. Conclusión

En las condiciones experimentales de la presente evaluación, realizada en cuatro estudios sucesivos mediante administración oral en el perro de vigilancia provisto de aparatos de telemetría:

• en administración única y comparativamente al grupo de control (n = 28), el aumento de la frecuencia cardiaca es claramente significativa y duradera con el F2207 con la dosis de 20 mg/kg/D; es estadística y clínicamente menor y más fugaz con el F2695 con la dosis equivalente farmacológicamente activa de 10 mg/kg/D,

• el F2695, con la dosis de 10 mg/kg/D, no provoca ninguna modificación estadísticamente significativa de la presión arterial sistólica mediada en las 6 horas después del último tratamiento, en el estado de equilibrio después de la administración reiterada durante 5 días,

• una diferencia estadísticamente significativa se demuestra sobre los valores de la presión arterial diastólica mediada en las 6 horas después del último tratamiento, en el estado de equilibrio después de la administración reiterada durante 5 días, entre el enantiómero activo F2695 (98 ± 2 mm Hg) y el racémico F2207 con dosis equivalentes farmacológicamente activas (110 ± 4 mm Hg).

Estas diferencias demuestran claramente una mejor tolerancia cardiovascular del enantiómero activo F2695.

Ejemplo 4: Ensayo de predictividad farmaco-toxico-genómica in vitro.

4.1. Materiales y métodos

Los compuestos F2695 y F2696, enantiómeros de la molécula racémica F2207, así como un producto de referencia, la clomipramina (codificada en el ensayo C218), se han evaluado durante el presente estudio. Los dos enantiómeros F2695 y F2696 se han evaluado en primer lugar en un ensayo preliminar de citotoxicidad (ensayo con el MTT) sobre unos hepacitos primarios de rata, a fin de seleccionar las tres concentraciones a usar en el ensayo definitivo.

Después del tratamiento de hepacitos primarios de rata en cultivo, se ha extraído el ARN a fin de generar unas sondas de ADN complementario marcadas, que, después, han sido hibridadas sobre una membrana que contiene 682 fragmentos de corte y empalme alternativo específicos del estrés celular. Se han obtenido unos índices de toxicidad, para cada uno de los productos ensayados, comparando el perfil de hibridación de las células tratadas con el obtenido a partir de células no tratadas.

4.1.1. Principio y objetivo del estudio

Safe-Hit es un ensayo farmaco-toxicogenómico predictivo sensible, robusto, fiable, rápido y seguro que permite la comparación y la clasificación de productos, basado en la evaluación optimizada de su potencial tóxico.

Safe-Hit se beneficia de una tecnología, propiedad de EXONHIT (DATASTM: Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing), que permite aislar y, por consiguiente, clonar los eventos de corte y empalme que resultan de un estado biológico dado, en comparación con una condición de control. Esto permite el aislamiento de isoformas de ARNm, expresadas de forma diferente en función de la condición biológica.

Safe-Hit permite la clasificación de las moléculas en el seno de una serie química, en función de un Índice Tóxico, determinado después de las etapas de base siguientes (sistemáticamente realizadas por duplicado para cada producto):

- tratamiento de las líneas celulares con los diferentes productos, con tres concentraciones deducidas de un ensayo previo de toxicología celular (ensayo MTT): correspondiendo una concentración de referencia a 80% de viabilidad celular, una concentración 10 veces superior -cuando es posible -y una concentración 10 veces inferior,

- preparación del ARN total y de las sondas radiomarcadas de ADNc correspondientes,

- hibridación de las sondas de ADNc: Safe-Hit macro-array que contiene 682 clones independientes, que corresponden a unas modificaciones de corte y empalme inducidas por la sobre-expresión de WTp53 (p53 es el “mediador” más ubicuo del estrés celular seleccionado para el desarrollo de esta metodología),

- adquisición y determinación del Índice de Toxicidad.

4.1.2. Células

18 5

45

55

Las células usadas para el estudio (ensayo MTT previo de citotoxicidad y ensayo principal) son unos hepatocitos criopreservados de rata Sprague-Dawley en primocultivo (lotes Hep184005 y Hep184006 -Biopredic), cultivados en condiciones estándares.

4.1.2.1. Medios de cultivo

- medio de descongelación: medio de Leibovitz 15 con glutamax 1, adicionado con 100 IU/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 0,6 M de glucosa (lote MIL 210009 -Biopredic),

- medio de inoculación: medio de Williams E con glutamax 1, adicionado con 100 IU/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 4 µg/ml de insulina bovina y 10% v/v de suero de ternera fetal (lote MIL 260005 -Biopredic),

- medio de incubación: medio de Williams E con glutamax 1, adicionado con 100 IU/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 4 µg/ml de insulina bovina y 50 µM de hemisuccinato de hidrocortisona (lote MIL 260009-260007 -Biopredic).

4.1.2.2. Condiciones de cultivo

37ºC, atmósfera CO2 (5%), higrometría relativa (95%).

4.1.2.3. Procedimiento de cultivo

Ensayo de toxicidad celular Estudio principal Células inoculadas el día del tratamiento Densidad de inoculación 35.000 células/pocillo (placas de 96 pocillos) 1,5 millones de células por placa de 30 mm Volumen de medio 0,1 ml 3 ml

4.1.3. Ensayo de citotoxicidad

Este ensayo de citotoxicidad (ensayo MTT) detecta las células vivas gracias a una reacción colorimétrica que revela la integridad de la respiración celular que implica la actividad de las mitocondrias. El MTT (bromuro de 3-[4,5dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio), soluble en agua, se transforma mediante escisión, bajo la acción de una enzima mitocondrial de las células vivas, en un formazán púrpura insoluble. El formazán se solubiliza en un disolvente orgánico, y la disolución obtenida se puede medir mediante espectrofotometría. La absorbancia medida es proporcional al número de células supervivientes.

Las células se ponen en contacto durante 16 horas con el producto a ensayar con 5 concentraciones diferentes (0 1 -10 -25 -50 y 100 µM).

Después de esta fase de exposición, se añade una disolución de MTT (0,5 mg/ml en el medio de incubación de los hepatocitos primarios) durante 3 horas. Después de la solubilización de los cristales de formazán, las placas multipocillo se leen mediante un espectrofotómetro a 500 nm a fin de determinar el porcentaje de viabilidad celular.

4.1.1. Estudio principal de farmaco-toxicogénomica

El estudio principal se realiza por duplicado, a partir de los cultivos inoculados y expuestos a cada producto, a fin de aumentar la coherencia entre los experimentos y validar los resultados obtenidos.

4.1.4.1. Inoculaciones celulares y tratamiento

Las células se inoculan y se cultivan durante 16 horas con cada producto, con las tres concentraciones seleccionadas a partir del ensayo previo MTT; se añaden dos controles (células no tratadas, disolvente solo) para la serie.

4.1.4.2. Extracción del ARN total y dosificación

Después del tratamiento, el ARN se extrae y se analiza como sigue:

- recogida de las células y centrifugación, - extracción realizada con un agente reactivo fenol listo para el uso (Trizol -lote 1106266 y 1121067 -Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante,

19

- solubilización del ARN en agua,

- dosificación del ARN en espectrofotometría (densidad óptica medida a 260, 280 y 300 nm),

- verificación de la calidad del ARN mediante Agilent.

4.1.4.3. Preparación de las sondas de ADNc

Las sondas de ADNc se preparan mediante transcripción inversa radioactiva (alfa dATP33P -Amersham). Se realiza la cuantificación de ADNc radioactivo (Instant Imager -Packard) para confirmar la actividad de las sondas.

4.1.4.4. Hibridación sobre membrana Safe-Hit

En las membranas Safe-Hit de nylon precortado (Q-BIOgene) se disponen en doble 682 clones DATAS (motivos de corte y empalme alternativo), con la ayuda de un aparato de Q-Pix (GENETIX). Las sondas de ADN se hibridan durante la noche sobre las membranas, y después se lavan.

4.1.1.5. Preparación de las sondas de ADNc:

- matriz: 5 µg de ARN total (para cada serie de tratamiento y para cada concentración),

- cebador: 100 ng de oligonucleótido oligo-dTV, para la 1ª y la 2ª hibridación sobre la rata (lote 12.00, Invitrogen),

- mezcla principal:

10 µl de tampón First Strand 5x Premier (lote 1131226 -Invitrogen)

1 µl de dCTP+dGTP+dTTP 20 mM (lote 1105201 -Invitrogen)

1 µM de ATP 120 µM (lote 1105201-Invitrogen)

5 µl de ditiotreitol (DTT) 0,1 M (lote 133609 -Invitrogen)

1 µl de ARNasa Out 40 U (lote 1113345 -Invitrogen)

5 µl de α 33P dATP 3000Ci/mmol 10 mCi/µl (lote B0239 -Amersham)

4 µl de Superscript II (lote 1137806 -Invitrogen)

1 µl de glucógeno (lote 1129328 -Invitrogen)

- procedimiento:

Incubar el ARN y el oligo-dTV a 70ºC durante 10 minutos, y después poner en hielo. Añadir 27 µl de MasterMix e incubar a continuación a 43ºC/1 hora y después a 50ºC/15 minutos. Añadir 20 µl de agua, y después 20 µl de EDTA 50 mM, y a continuación 4 µl de NaOH 10N. Incubar durante 20 minutos a 65ºC y después poner en hielo.

Cuantificación: Instant Imager, Packard: 1 µl de mezcla de reacción, añadir 8 µl de ácido acético, 100 µl de isopropanol y 1 µl de glucógeno (20 µg/µl). Incubar a -20ºC durante 20 minutos, centrifugar durante 20 minutos a 13.000 v/min. a 4ºC. Resuspender en 200 µl de agua,

Cuantificación: Instant Imager, Packard: 1 µl de mezcla de reacción.

- Medios y tampones Disoluciones comunes: Tampón de lavado 1: 20X SSC (Invitrogen) 50X Denhardt's 50% (w/v) Sulfato de Dextrano (ICN) 20% SDS (v/v)(Quantum biotech.) 10 mg/ml ADN de esperma de salmón (Q-Biogene) 2X SSC Tampón de pre-hibridación: Tampón de lavado 2: 6X SSC 10X Denhardt's 10% Sulfato de Dextrano 0,5% SDS H2O 2X SSC 0,1% SDS

Tampón de hibridación: Tampón de lavado 3:

5X SSC 0,5X SSC 5X Denhardt's 0,1% SDS 0,1% SDS H2O

Tampón de lavado 4:

1X SSC 0,1% SDS

- Pre-hibridación

Alicuotar 5 ml de tampón de pre-hibridación en los tubos de hibridación, añadir el volumen correspondiente de ADN de esperma de salmón para una concentración final de 100 µg/ml,

empapar las membranas de 5X SSC,

disponer la membrana en el tubo de hibridación y pre-hibridación durante 2 horas a 65ºC.

- Hibridación

Eliminar el tampón de pre-hibridación y aclarar con 10-20 ml de 5 X SSC, eliminar el 5 X SSC, sustituir por 5 ml de tampón + ADN de esperma de salmón, desnaturalizar las sondas RT durante 5 mn a 95ºC, y después colocar sobre hielo durante 1 minuto, centrifugar para la reconstitución, y recuperar a continuación el volumen apropiado de sontas RT desnaturalizadas en el tubo (100.000 a 200.000 cpm/ml), incubar durante una noche a 55ºC.

- Lavado:

Aclarar las membranas con 10-20 ml de tampón de lavado 1, eliminar el tampón y sustituirlo por 50 ml de tampón de lavado 2, incubar durante 30 min. a 55ºC, y después eliminarlo y sustituirlo lavando con el tampón 4, incubar durante 30 min. a 55ºC, y decantar a continuación el lavado final, quitar las membranas de los tubos, disponer sobre un casete y dejar que la adquisición se realice durante 3 horas.

4.1.4.5. Adquisición y análisis de imagen

Las membranas se disponen sobre una pantalla (FX Imaging ScreenK – Bio-rad) durante 3 horas. La película se lee a continuación utilizando un Personal Molecular Imagen FX (Bio-rad). El análisis de imagen se realiza utilizando el programa Safe-Hit Reader (COSE).

4.1.4.6. Cálculo del índice de toxicidad

Todos los datos se transfieren a un programa de cálculo automático que normaliza las diferentes membranas y calcula un índice de toxicidad = suma del número aumentado y disminuido de genes para un compuesto dado a una concentración dada, comparativamente con los resultados de los controles no tratados. Los resultados de los dos análisis Safe-Hit se comparan entonces y se combinan para evaluar la toxicidad potencial de los diversos compuestos ensayados. Dos parámetros modificables por el usuario están implicados en el cálculo del índice de toxicidad:

• el Background Threshold (BT) atenúa las señales débiles, próximas del ruido de fondo o no atribuibles a una expresión significativa de gen. Determina por lo tanto el nivel de detección;

• el factor de inducción (IF) se determina como el factor multiplicador, frente a las muestras de control, para que aumenten o disminuyan los clones. El valor de este parámetro es generalmente 2 o por debajo de 2 para obtener unos resultados relevantes. El aumento progresivo del valor del IF selecciona los clones que aumentan o disminuyen cada vez más.

El procedimiento de cálculo del índice de toxicidad se ha desarrollado mediante la comparación de los perfiles de referencia (R: células no tratadas) con un perfil experimental (E) y sigue las etapas siguientes (véase la figura 5) para una vista esquemática del procedimiento):

- transformación de todos los vales obtenidos en valores log,

- cálculo de la media de los valores log para cada uno de los ensayos duplicados (MiR y MiE),

21

- establecimiento de una matriz con MiR y MiE para todas las señales (= Di), -normalización de los MiE individuales sustrayendo a MiE la media de los 14 valores proximales de Di (=

NMiE), -comparación de los valores normalizados con los valores de referencia (Ci = NMiE -MiR), -transformación exponencial de Ci (= Fi), -comparación de Fi con el factor de inducción seleccionado por el usuario:

• si Fi > IF, el gen se considera como aumentado,

• si 1/IF < Fi < IF, el gen se expresa sin ninguna modificación,

• si Fi < 1/IF, el gen se considera como disminuido.

4.2. RESULTADOS DEL ENSAYO CON EL MTT

Estos ensayos se han realizado por triplicado sobre unos hepatocitos primarios de ratas expuestos durante 16 horas.

La clomipramina, referenciada C218, presenta una toxicidad importante a 100 µM debido a que no se observa ninguna viabilidad después de la exposición de las células durante 16 horas. Por el contrario, no se observa ninguna toxicidad a 25 µM. A 50 µM, la viabilidad superior al 80% es totalmente compatible con un estudio farmacotoxicogenómico. Los compuestos F2695 y F2696 no presentan ninguna toxicidad en este ensayo, incluso con la concentración de 100 µM.

Para realizar las evaluaciones farmaco-toxicogenómicas, se usan 3 concentraciones de un mismo compuesto: la concentración que permite obtener 80% de viabilidad (C), así como las concentraciones que corresponden a (C)x10 y a (C)/10.

A fin de comparar la capacidad de F2695 y F2696 para producir un resultado en el ensayo realizado, se han usado las mismas concentraciones para cada uno de ellos: 1 µM, 10 µM y 100 µM. En el caso de la clomipramina, se han usado las concentraciones de 1 µM, 10µMy 50 µM. Véanse las figuras 6a, 6b y 6c.

4.3 RESULTADOS SOBRE HEPATOCITOS PRIMARIOS DE RATA

Los índices de toxicidad (IT) se han determinado como se ha descrito anteriormente. En estos índices, se ha tomado en cuenta sólo los clones que han sido encontrados modulados con relación a los controles en los dos experimentos independientes, considerando sólo los clones cuya señal es 2 veces superior al ruido de fondo (BT). Se han realizado dos análisis diferentes tomando dos niveles de diferencia (Factor de inducción -IF) con relación a la situación no tratada:

- por lo menos 1,7 veces con relación a la situación no tratada. Este factor de 1,7 veces representa el valor más bajo que permite no obtener ningún índice durante la comparación de dos situaciones no tratadas.

- por lo menos 2 veces con relación a la situación no tratada. Este factor de 2 veces permite tomar en cuenta las señales más robustas.

4.3.1. Factor de inducción de 1,7 con relación a la situación no tratada (tabla 6)

22

**(Ver fórmula)**

Pos. nb U nb D Gen A09 3 2,90 2,23 2,14 H. sapiens mitochondrion, 12SA20 1 0,56 H. sapiens initiation factor elF-5A genB20 2 0,14 0,27 H. sapiens chromosome 19; BAC CIT-B-191n6B22 2 0,17 0,32 H. sapiens Genomic sequence from 17C01 4 3,20 1,93 1,82 1,91 H. sapiens mitochondrion, 16SE01 1 1,73 H. sapiens mRNA for lipocortin IIE05 2 0,22 0,35 H. sapiens DNA sequence from clone 740A11 on chromosome Xq22.2-23.Contains part of the COL4A5 for Collagen Alpha 5 (IV) Chain Precursor. Contains GSS1, completesequence E11 1 2,12 H. sapiens chlordecone reductase homolog liver, mRNAE19 1 1,72 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1E21 2 0,56 0,58 H. sapiens ribosomal protein S14 geneF24 1 0,52 H. sapiens LIM homeobox protein cofactor (CLIM-1) mRNAG01 1 2,04 H. sapiens estrogen receptor-related protein (variant ER from breast cancer) mRNAG05 1 2,02 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1G09 2 2,09 1,76 H. sapiens mitochondrion, cytochrome bI01 1 2,05 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1I18 2 2,38 1,88 H. sapiens 18S rRNA geneH. sapiens divalent cation tolerant protein CUTA mRNAL01 1 2,05 L22 1 1,78 H. sapiens mRNA for Lon protease-like proteinL23 1 1,75 H. sapiens cDNA NIH mgC_16 clone IMAGE:3350241 5', mRNA sequenceM07 2 2,25 1,75 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1M12 3 0,21 0,16 0,39 H. sapiens mRNA; cDNA DKFZp564C1563M23 1 1,95 Sequence 21 from patent US 5851764P05 1 1,78 H. sapiens PAC clone DJ404K21 from Xq23Q11 2 1,81 1,92 unk Q24 1 1,77 H. sapiens 28S ribosomal RNA geneS01 1 2,98 Mus muculus TCR beta locusT08 6 0,50 0,22 0,20 0,35 0,14 0,22 H. sapiens mRNA for I IAA1185 proteinU04 6 0,57 0,26 0,19 0,48 0,22 0,37 H. sapiens translation initiation factor elF-2alpha mRNAV22 H. sapiens mRNA for elongation factor 1-alpha (clone CEF4)W17 1 2,96 H. sapiens mitochondrion, hypoxia inducible gene-14X02 5 0,29 0,20 0,36 0,24 0,31 unk X05 2 0,15 0,24 H. sapiens microsomal epoxide hydrolase (EPHX) geneX06 5 0,2 0,16 0,23 0,15 0,23 H. sapiens Genomic sequence from 9q34X23 1 1,92 unk Y17 1 2,65 H. sapiens 28S ribosomal RNA geneZ13 3 0,34 0,29 0,27 unk Z20 1 0,57 Homo sapiens cDNA wc44h09,x1 NCI_CGAP_Pr28 clone IMAGE:2321537 3' similar to SW:RB24_Mouse P35290 RAS_RELATED PROTEIN RAB-24;, mRNA sequenceAA11 3 0,38 0,27 0,31 H. sapiens Repeat sequence AluJb fragment inserted into a cDNA coding for an unknown proteinAÁ13 1 1,79 H. sapiens 18S rRNA geneAC13 5 0,22 0,16 0,28 0,16 0,28 H. sapiens 7S RNA L gene

Se han obtenido los índices de toxicidad siguientes:

F2695 Índice de toxicidad 1 µM 0 10 µM 0 100 µM 17 F2696 Índice de toxicidad 1 µM 2 10 µM 5 100 µM 22 C218 Índice de toxicidad 1 µM 9 10 µM 15 50 µM 28

5 Por lo tanto, se puede establecer la clasificación siguiente, del más tóxico por lo menos tóxico C218 (clomipramina) > F2695 >>> F2695.

La clomipramina, molécula de referencia codificada en el presente ensayo C218, muestra un aumento de las firmas en relación con las concentraciones ensayadas: respectivamente 9, 15 y 28 firmas con las concentraciones de 1, 10 y 50 µM (concentración máxima definida en el ensayo previo de citotoxicidad). Muy lógicamente, la totalidad de las firmas que aparecen con las concentraciones baja y media se encuentra con las concentraciones superiores.

Con las concentraciones de 1 y 10 µM, el F2695 no induce ninguna firma sobre las 682 posibles firmas de estrés ensayadas en el presente ensayo. Con la concentración más elevada de 100 µM, sólo se identifican dos firmas, de las cuales una es común con el C218 pero de significado desconocido.

El F2696 muestra un aumento de las firmas en relación con las concentraciones ensayadas: respectivamente 2, 5 y 22 firmas con las concentraciones de 1, 10 y 100 µM. La totalidad de las firmas que aparecen con las concentraciones baja y media se encuentra con las concentraciones superiores. Ninguna de las 22 firmas es común con el F2695. Por el contrario, las firmas que aparecen con las concentraciones baja y media (5 de las cuales 2 están presentes a partir de la baja concentración), las 5 forman todas parte de las 9 firmas objetivadas para la clomipramina a partir de la dosis baja de 1 µM. Con la alta concentración de 100 µM, 10/26 firmas del F2696 se encuentran entre las 28 identificadas con la clomipramina a 50 µM.

25 En el plano cualitativo, se debe subrayar para el F2696 y la clomipramina el impacto sobre los transcritos mitocondriales, en particular a nivel de Cox1 y del citocromo b. Estas firmas no están presentes con el F2695 (posiciones G05/G09/I01). 4.3.2. Factor de inducción de 2 con relación a la situación no tratada (tabla 7)

TABLA 7: clones aumentados y disminuidos con unos hepatocitos primarios de rata (Factor de inducción = 2 veces)

Aumento >1,7 Disminución <0,588

F2695 -1 µM F2695 10 µM F2695 -100 µM F2696 1 µM F2696 -10 µM F2696 100 µM C218 1 µM C218 10 µM C218 100 µM Aumento 10 1 1 4 Disminución 5 6 7 12 12 TI 5 16 8 13 16 Pos. nb U nb D Gen A09 3 2,90 2,23 2,14 H. sapiens mitochondrion, 12SB20 2 0,14 0,27 H. sapiens chromosome 19; BAC CIT-B-191n6B22 2 0,17 0,32 H. sapiens Genomic sequence from 17C01 4 3,20 1,93 1,82 1,91 H. sapiens mitochondrion, 16SE05 2 0,22 0,35 H. sapiens DNA sequence from clone 740A11 on chromosome Xq22.223.Contains part of the COL4A5 gene for Collagen Alpha 5 (IV) ChainPrecursor. Contains GSS1, complete sequenceE11 1 2,12 H. sapiens chlordecone reductase homolog liver, mRNAG01 1 2,04 H. sapiens estrogen receptor-related protein (variant ER from breastcancer) mRNAG05 1 2,02 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1G09 2 2,09 H. sapiens mitochondrion, cytochrome bI01 1 2,05 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1I18 2 2,38 H. sapiens 18S rRNA geneH. sapiens divalent cation tolerant protein CUTA mRNAI18 1 2,38 H. sapiens 18S rRNA geneJ03 1 2,12 H. sapiens CLP mRNAL01 1 2,05 H. sapiens divalent cation tolerant protein CUTA mRNAM07 2 2,25 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1M12 3 0,21 0,16 0,39 H. sapiens mRNA; cDNA DKFZp564C1563T08 5 0,22 0,20 0,35 0,14 0,22 H. sapiens mRNA for I IAA1185 proteinU04 5 0,26 0,19 0,48 0,22 0,37 H. sapiens translation initiation factor elF-2alpha mRNAW17 1 2,96 H. sapiens mitochondrion, hypoxia inducible gene-14X02 5 0,29 0,20 0,36 0,24 0,31 unk X05 2 0,15 0,24 H. sapiens microsomal epoxide hydrolase (EPHX) geneX06 5 0,20 0,16 0,23 0,15 0,23 H. sapiens Genomic sequence from 9q34Y17 1 2,65 H. sapiens 28S ribosomal RNA geneZ13 3 0,34 0,29 0,27 unk AA11 3 0,38 0,27 0,31 H. sapiens Repeat sequence AluJb fragment inserted into a cDNA coding for an unknown proteinAC13 5 0,22 0,16 0,28 0,16 0,28 H. sapiens 7S RNA L gene

Se han obtenido los índices siguientes:

F2695 Índice de toxicidad 1 µM 0 10 µM 0 100 µM 0 C218 Índice de toxicidad 1 µM 8 10 µM 13 50 µM 16 F2696 Índice de toxicidad 1 µM 0 10 µM 5 100 µM 16

Según estos parámetros, se puede proponer la siguiente clasificación, del más tóxico por lo menos tóxico: C218 (clomipramina) > F2696 >>>>> F2695. Considerando los clones sobre-o sub-expresados de un factor 2, el F2695 no induce ninguna firma, incluso con la concentración de 100 µM.

El efecto de la concentración sobre la aparición de las firmas se confirma mediante la desaparición de las firmas de baja intensidad para el F2696 con 1 µM, presentes en el análisis anterior con un factor de inducción de 1,7.

15 Se confirma asimismo, en el plano cualitativo, el impacto de F2696 y de la clomipramina sobre Cox1 y citocromo b (posiciones G05/G09/I01).

El F2695, enantiómero farmacológicamente activo del F2207, está desprovisto de impacto significativo en este 20 ensayo, mientras que la clomipramina se usa como producto de referencia de control positivo.

Por el contrario, el F2696, enantiómero inactivo del F2207 presenta un perfil de firmas cuantitativa y cualitativamente cercano a la clomipramina, y no presenta ninguna firma común con el F2695. Todo esto demuestra un mejor perfil toxicogenómico para el enantiómero activo F2695 del que, en este modelo experimental, el coeficiente de seguridad es significativamente mejor que para el F2696.

4.4. Conclusión Los estudios farmaco-toxicogenómicos realizados sobre las moléculas F2695 y F2696, enantiómeros del F2207 (con las concentraciones de 10, 50 y 100 µM), y C218 (clomipramina, con las concentraciones de 1, 10 y 50 µM), a partir de hepatocitos de rata en primocultivo, han permitido obtener unas firmas de estrés y unos índices de toxicidad dependientes de la concentración. Estos estudios confirman la capacidad del ensayo farmacotoxicogenómico para revelar unas firmas de estrés en unas condiciones de tratamiento (concentraciones, duración de tratamiento) que no provocan ninguna toxicidad en un ensayo habitual de viabilidad tal como el MTT.

Varios hechos destacan de este estudio:

• en este modelo de hepatocitos primarios de rata, sólo el F2695, enantiómero farmacológicamente activo del 40 F2207 no induce ningún índice de toxicidad significativo;

• el F2696, enantiómero inactivo del F2207, y la clomipramina, psicótropo de referencia, inducen unos índices importantes formados por firmas de estrés comunes o muy cercanas. En este sistema, la clomipramina, molécula de referencia producida positiva, es el producto que induce más firmas de estrés,

45 obteniéndose unos índices significativos a partir de las concentraciones más bajas. En este sentido, es interesante mencionar que la clomipramina puede inducir un cierto número de efectos indeseables en el ser humano, tales como por ejemplo la taquicardia, la hipotensión ortostática, unos trastornos de la conducta o del ritmo y, excepcionalmente unas hepatitis. En caso de sobredosis accidental con la clomipramina, se pueden observar entre otros unos síncopes, unos trastornos hematológicos, unas manifestaciones

50 cardiovasculares severas.

Sin prejuzgar una identidad de mecanismo fisiopatológica, es interesante observar que F2696 presenta unas firmas de estrés comunes o muy cercanas a las de la clomipramina, e induce asimismo unos efectos indeseables tales como los trastornos cardiovasculares descritos anteriormente.

Así, es legítimo adelantar que las firmas observadas son independientes de cualquier perfil antidepresivo o más ampliamente psicotrópico. Se deben considerar, por el contrario, como unas “firmas de estrés” (el F2696 provoca en particular una disminución de expresión de un gen implicado en la síntesis proteica y de un factor de iniciación de traslación). Todo esto demuestra un mejor perfil toxicogenómico para el enantiómero activo F2695, cuyo coeficiente de seguridad en el modelo experimental es significativamente mejor que para el F2696.




Reivindicaciones:

REIVINDICAIONES

1. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su utilización como medicamento destinado a prevenir o a tratar la depresión, los estados depresivos, la fibromialgia, el síndrome de fatiga crónica, el dolor, en pacientes que presentan unos antecedentes cardiovasculares y/o que padecen trastornos cardiovasculares, administrado a una dosis comprendida entre 0,01 mg y 10 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas.

2. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis administrada está comprendida entre 0,05 mg y 5 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas.

3. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la dosis administrada está comprendida entre 0,1 mg y 1 mg/kg de peso corporal por día en una o varias tomas.

4. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los trastornos cardiovasculares corresponden a un aumento de la presión arterial y/o a un aumento de la frecuencia cardiaca.

5. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación 4, caracterizado porque el aumento de la presión arterial corresponde a un aumento de la presión arterial diastólica.

6. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, limitando además al mismo tiempo los riesgos de toxicidad orgánica y/o tisular.

7. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán es el clorhidrato de Z-(1S,2R)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1fenilciclopropanocarboxamida (F2695).

8. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el tratamiento o la prevención de la depresión profunda, de la depresión resistente, de la depresión de la persona mayor, de la depresión psicótica, de la depresión inducida por unos tratamientos con interferón, del estado depresivo, del síndrome maniaco-depresivo, de los episodios depresivos estacionales, de los episodios depresivos relacionados con una condición médica general o de los episodios depresivos relacionados con unas sustancias que actúan sobre el humor.

9. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el tratamiento o la prevención del dolor crónico.

10. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los antecedentes cardiovasculares y/o trastornos cardiovasculares se seleccionan de entre el infarto de miocardio, los trastornos del ritmo cardiaco (taquicardia, bradicardia, palpitaciones), los trastornos de la presión arterial (pacientes hipo-o hipertensos) y las cardiopatías.

11. Enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán (Z(±)-2-(aminometil)-N,N-dietil-1-fenilciclopropanocarboxamida), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el medicamento contiene:

a) dicho enantiómero (1S,2R) del Milnaciprán o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y

b) por lo menos un compuesto activo seleccionado de entre los psicótropos, en particular los antidepresivos, y los agentes anti-muscarínicos,

como productos de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo para el tratamiento o la prevención de la depresión, en particular la depresión profunda, la depresión resistente, la depresión de la persona mayor, la depresión psicótica, la depresión inducida por unos tratamientos con interferón, el estado depresivo, el síndrome maniaco-depresivo, los episodios depresivos estacionales, los episodios depresivos relacionados con una condición médica general, o los episodios depresivos relacionados con unas sustancias que actúan sobre el humor.






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