Uso de chaperonas moleculares para aumentar la producción de proteínas recombinantes secretadas en células de mamífero.

Una célula hospedadora de mamífero para mejorar la expresión de un producto proteico recombinante,

teniendo dicha célula de mamífero un material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante y se transforma con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70, en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

Uso de chaperonas moleculares para aumentar la producción de proteínas recombinantes secretadas en células de mamífero Campo de la invención La presente invención se refiere al campo general de la producción de proteínas recombinantes en una célula hospedadora de mamífero. Específicamente, la presente invención se refiere a aumentar la producción de un producto proteico recombinante secretado mediante la coexpresión de al menos una proteína chaperona Hsp70 en la célula hospedadora de mamífero.

Antecedentes de la invención En las células procariotas y eucariotas, las proteínas chaperonas moleculares catalizan el intercambio de enlaces disulfuro y ayudan en el plegamiento correcto de proteínas recién sintetizadas. Esta observación ha conducido a una gran cantidad de estudios y se han propuesto usos para estas proteínas de control de calidad. Por ejemplo, el aumento de la actividad pDI (proteína disulfuro isomerasa) en sistemas de expresión de células bacterianas, de insecto y de levadura puede tener efectos beneficiosos sobre la solubilidad de la proteína y el plegamiento y, en algunos casos, puede conducir a un aumento de la secreción de proteínas heterólogas (1-7) . Además, otros estudios han mostrado que la chaperona molecular, proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina (BiP, también conocida como proteína regulada por glucosa) y la proteína de choque térmico 70 humana (Hsp 70) , tienen un efecto beneficioso sobre la expresión de proteínas recombinantes en sistemas de células de insectos (5, 8-12) .

Las chaperonas moleculares no han tenido el mismo nivel de éxito sobre la expresión y la secreción de proteínas recombinantes en sistemas de células de mamífero. Por ejemplo, la hiperexpresión de la chaperona pDI en células de ovario de hámster chino (CHO) no solo no tuvo efecto sobre los niveles de secreción de IL-15, sino que además causó una disminución en la secreción, y un aumento de la retención celular de una proteína de fusión receptor de factor de necrosis tumoral-Fc (TNFR: Fc) (13) . Otros estudios han mostrado que la hiperexpresión de la chaperona BiP en células de mamífero puede conducir a una mayor retención celular y a una disminución de la secreción de proteínas recombinantes (14-15 y el documento de Patente de EE.UU. nº 4.912.040) . Los mecanismos reguladores implicados en el procesamiento de proteínas dentro de la célula de mamífero son complejos y probablemente implican la cooperación de muchas de estas proteínas chaperonas. Por lo tanto, no se puede predecir si una chaperona particular producirá un aumento de la producción de una determinada proteína recombinante.

Debido a las teorías contradictorias en este tema, el efecto de las proteínas chaperonas sobre la producción de un producto proteico recombinante secretado no se entiende ni se aprecia. El documento de Patente de EE.UU. nº

6.451.597 (la patente 597) describe un método para mejorar la producción de partículas víricas, y especula sobre el efecto de las chaperonas en la mejora del rendimiento de una proteína recombinante en células eucariotas. Sin embargo, no se describe ninguna expresión real de una proteína recombinante. Sin embargo, otros estudios han encontrado que la hiperexpresión de chaperonas en líneas de células eucariotas o bien no tuvo efecto sobre los rendimientos del producto o había una reducción de la secreción de las proteínas recombinantes (14, 15) . Véase también el documento de Patente de EE.UU. nº 4.912.040. Teniendo en cuenta las teorías contradictorias en este tema, la patente 597 no permite que un experto en la técnica utilice chaperonas para mejorar la producción y la secreción de una proteína recombinante en células eucariotas. El estado de la técnica no explica cómo predecir qué efecto va a tener una chaperona particular sobre la producción y la secreción de una proteína recombinante dada en modelos de cultivos celulares, tales como los descritos en el presente documento. Los solicitantes se sorprendieron en consecuencia, por encontrar que cuando las chaperonas descritas en este estudio se transfectaban en líneas celulares de mamífero que expresaban una proteína recombinante secretada, el efecto resultante era un aumento general en la producción de la proteína secretada.

Compendio de la invención En un aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedadora de mamífero para mejorar la expresión de un producto proteico recombinante, teniendo dicha célula de mamífero un material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante y estando transformada con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70, en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

En una realización del primer aspecto de la invención, el producto proteico recombinante se secreta.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

En otra realización de la invención, la célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una célula hospedadora de mamífero para mejorar la expresión de una proteína recombinante diana, en donde el método comprende proporcionar una célula de mamífero que tiene material genético que codifica para la expresión de una proteína recombinante diana; y transformar la célula de mamífero con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70, en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

En una realización del segundo aspecto de la invención, el producto proteico recombinante se secreta.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

En otra realización de la invención, la célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un producto proteico recombinante secretado, en donde el método comprende las etapas de: cultivar una célula hospedadora de mamífero, teniendo dicha célula hospedadora de mamífero material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante y que está transformada con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70 en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D; y recuperar a partir del medio de cultivo el producto proteico recombinante así producido y secretado de esta manera.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

En otra realización de la invención, la célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento de la proteína bikunina o IL2SA en una línea celular CHO en donde el material genético que codifica para la expresión de dicha bikunina o IL2SA recombinante se ha introducido previamente en una primera línea celular CHO, comprendiendo dicho método las etapas de: insertar al menos un vector de expresión de la proteína chaperona en dicha primera línea celular CHO para formar de este modo una línea celular CHO modificada; y seleccionar a partir de dicha línea celular CHO modificada al menos una segunda línea celular que muestra un rendimiento mejorado de la proteína bikunina o IL2SA recombinante; en donde el vector de expresión de la proteína chaperona comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70 en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D. En el método para mejorar el rendimiento de la proteína IL2SA, el método comprende... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora de mamífero para mejorar la expresión de un producto proteico recombinante, teniendo dicha célula de mamífero un material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante y se transforma con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70, en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

2. La célula hospedadora de mamífero según la reivindicación 1, en la que el producto proteico recombinante es secretado.

3. La célula hospedadora de mamífero según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

4. La célula hospedadora de mamífero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, transformada adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

5. Un método para producir una célula hospedadora de mamífero para mejorar la expresión de una proteína recombinante diana que comprende

proporcionar una célula de mamífero que tiene material genético que codifica para la expresión de una proteína recombinante diana; y

transformar la célula de mamífero con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70, en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

6. El método según la reivindicación 5, en el que el producto proteico recombinante es secretado.

7. El método según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, transformado adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

9. Un método para producir un producto proteico recombinante secretado que comprende las etapas de:

cultivar una célula hospedadora de mamífero, teniendo dicha célula hospedadora de mamífero un material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante y se transforma con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una chaperona Hsp70, en donde el producto proteico recombinante es el Factor VIII, y en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D; y

recuperar a partir del medio de cultivo el producto proteico recombinante producido y secretado de este modo.

10. El método según la reivindicación 9, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

11. El método según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde dicha célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

12. Un método para mejorar el rendimiento de proteína bikunina recombinante en una línea celular CHO, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicha bikunina recombinante se ha introducido previamente en una primera línea celular CHO, comprendiendo dicho método las etapas de:

insertar al menos un vector de expresión de la proteína chaperona en dicha primera línea celular CHO para formar de este modo una línea celular CHO modificada; y

seleccionar a partir de dicha línea celular CHO modificada al menos una segunda línea celular que muestra un mayor rendimiento de la proteína bikunina recombinante,

en donde el vector de expresión de la proteína chaperona comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70 en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

13. El método según la reivindicación 12, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicha bikunina recombinante está integrado en el ADN de la primera célula CHO.

14. El método según la reivindicación 12, en el que dicha selección se produce en presencia de G418.

15. Un método para mejorar el rendimiento de Factor VIII recombinante en una línea celular de riñón de cría de hámster (BHK) , en donde el material genético que codifica para la expresión de dicho Factor VIII recombinante se ha introducido previamente en una primera línea celular BHK, comprendiendo dicho método las etapas de:

insertar al menos un vector de expresión de la proteína chaperona en dicha primera línea celular BHK de modo que se forma una línea celular BHK modificada; y

seleccionar a partir de dicha línea celular BHK modificada al menos una segunda línea celular que muestra un mayor rendimiento del producto del Factor VIII recombinante,

en donde el vector de expresión de la proteína chaperona comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70 en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

16. El método según la reivindicación 15, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicho Factor VIII recombinante está integrado en el ADN de la primera célula BHK.

17. El método según la reivindicación 15, en el que dicha célula BHK se transfecta adicionalmente con un vector que incluye un gen de resistencia a la puromicina.

18. El método según la reivindicación 15, en el que la selección tiene lugar en presencia de puromicina.

19. Un método para mejorar el rendimiento de proteína IL2SA recombinante en una línea celular CHO, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicha IL2SA recombinante se ha introducido previamente en una primera línea celular CHO, comprendiendo dicho método las etapas de:

insertar al menos un vector de expresión de proteína chaperona en dicha primera línea celular CHO para formar de este modo una línea celular CHO modificada;

seleccionar a partir de dicha línea celular CHO modificada al menos una segunda línea celular que muestra un mayor rendimiento de la proteína IL2SA recombinante; e insertar un vector de expresión de sintetasa de glutamina en dicha al menos una segunda línea celular,

en donde el vector de expresión de la proteína chaperona comprende ADN que codifica una proteína chaperona Hsp70 en donde el ADN que codifica la proteína chaperona Hsp70 consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la Figura 2D.

20. El método según la reivindicación 19, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicha IL2SA recombinante está integrado en el ADN de la primera célula CHO.

21. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en el que la segunda línea celular se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, en el que se produce al menos una segunda línea celular a partir de dicha primera línea celular mediante la selección de una porción de dicha primera línea celular que muestra la integración del vector de expresión de la proteína chaperona en el ADN del hospedador.