Uso de CD154 para la identificación y separación de células T no-reguladoras a partir de una mezcla de células T reguladoras.

Método de separación de células-T reguladoras activadas de una mezcla que comprende las células-Treguladoras activadas y células-T convencionales activadas al poner en contacto la mezcla de células con unamolécula que se une a CD154 y la depleción de las células-T CD154+ de la mezcla y obtener así una poblaciónde células-T reguladoras activadas.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10175578.

Solicitante: MILTENYI BIOTEC GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Friedrich-Ebert-Str 68 51429 Bergisch-Gladbach ALEMANIA.

Inventor/es: THIEL, ANDREAS, DR., KOHLER,SIEGFRIED, SCHÖNBRUNN,ANNE, MÜLLER,ROBIN, FRENTSCH,MARCO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/569 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.

PDF original: ES-2399027_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Uso de CD154 para la identificación y separación de células T no-reguladoras a partir de una mezcla de células T reguladoras.

Campo de la invención La invención se relaciona generalmente con el campo de la inmunología, particularmente el campo de la separación de células. La presente invención se refiere al uso de la molécula CD154 (ligando de CD40) para identificar y separar células-T no-reguladoras (células-T convencionales) de una mezcla que comprende células-T reguladoras.

Antecedentes de la invención Las células-T específicas, las cuales suprimen activamente las respuestas inmunes no deseadas tales como, por ejemplo, a estructuras endógenas (auto-antígenos) existen en el organismo. Ellas se denominan como células-T reguladoras (Treg) . Las células-T reguladoras se involucran esencialmente en el mantenimiento a lo largo de la vida de la tolerancia periférica a auto-antígenos. Ellas se producen en el timo, pero la actividad de las mismas se reduce grandemente con el aumento de la edad.

Las células-T reguladoras pueden llevar a la supresión de las respuestas anti-tumorales como se muestra por ejemplo por Onizuka y otros, Cancer Res.1999, vol.59, p.3128-3133 y Shimizu y otros, J. Immunol. 1999, vol. 163, p.5211-5218, debido a que muchos antígenos tumorales representan auto-antígenos clásicos. En contraste, números reducidos de Treg o alteraciones funcionales en Treg pueden llevar a enfermedades autoinmunes durante las cuales las estructuras endógenas se atacan de una manera no controlada como sustancias foráneas o patógenos.

Las Treg se involucran en el mantenimiento de la auto-tolerancia inmunológica, en que ellas inhiben la activación de las células T auto-reactivas. Ellas son capaces de suprimir tanto la producción de citocinas como también la proliferación de tales células-T potencialmente patogénicas. Una etapa esencial en la identificación de células-T auxiliadoras reguladoras fue la caracterización de las células T-auxiliadoras CD4+, las cuales incluyen la proteína de la cadena-alfa constitutiva del receptor de interleucina-2 (IL-2) (CD25) como una proteína de la superficie de la membrana. La significación funcional y el mecanismo molecular exacto de la supresión de estas células-T reguladoras CD25+CD4+ y además la manera en la cual ellas surgen no se elucidó hasta ahora. A partir de que el receptor CD25 se expresa además por subpoblaciones de células T no-reguladoras, este marcador solo se puede usar provisionalmente para analizar y concentrar Treg. CD25 no puede, sin embargo, usarse particularmente para identificar y separar células-T reguladoras activadas específicas por el antígeno.

El aislamiento de Treg sin células-T convencionales contaminantes y particularmente de Treg específicas por ciertos antígenos es, sin embargo, uno de los grandes objetivos terapéuticos. Esto es además cierto para el análisis de las Treg y las Treg específicas por el antígeno. Las Treg específicas por (auto) antígenos son un medio específico para suprimir respuestas inmunes no deseadas tales como, por ejemplo, reacciones autoinmunes en la artritis reumatoide (RA) , esclerosis múltiple (MS) , aterosclerosis (AS) , diabetes, y soriasis. Otras respuestas inmunes no deseadas en las cuales las Treg pudieran representar un medio específico son GvHD (enfermedad de injerto contra huésped) en trasplantes alogénicos de células madres o el rechazo de trasplantes en trasplante de órganos (Hara y otros, J. lmmunol. 166: 3789-3796 (2001) ; Taylor y otros, J. Exp. Med. 193: 1311-1318 (2001) ) . Las alergias representan además respuestas inmunes no deseadas para las cuales están disponibles hasta la fecha solamente unas pocas opciones terapéuticas. Un tratamiento terapéutico con Treg, el cual se basa en el principio natural de la tolerancia periférica y que se demostró en muchos modelos experimentales que no involucra ningún efecto colateral en comparación con medicamentos convencionales y que podría ser curativo.

En relación con el potencial establecido de las Treg, las moléculas y mecanismos involucrados en la supresión, y marcadores de Treg confiables, son de gran importancia. Un marcador biológico molecular de Treg, el represor de la transcripción FoxP3, el cual pertenece a la familia-cabeza de tenedor, se reconoce en la materia. (Hori y otros, (2003) Science 99 (5609) : 1057-61) . Adicionalmente, las células-T reguladoras se pueden identificar sobre las bases de la expresión de la molécula CD25 (Thornton y Shevach (1998) J. Exp. Med. 188 287-296; Sakaguchi y otros (1995) J. Immunol. 155 1151-1164) .

Hasta la fecha, sin embargo, no fue posible identificar y aislar aquellas células Treg, las cuales reconocen un antígeno específico. Esto sería posible si las Treg activadas específicamente se pudieran separar. Esto sería un pre-requisito para terapias específicas con Treg, por ejemplo, para enfermedades autoinmunes en las cuales la reacción autoinmune subyacente a la enfermedad se debe suprimir, pero no aquellas reacciones inmunes que se lanzan contra células tumorales.

De acuerdo con Choi y otros, (2004, JLB) , no existen evidencias de que CD137 (4-1 BB) se pueda emplear como un marcador discriminativo para Treg contra CD25. En una solicitud internacional (documento WO 2007/110249) , se describe que las Treg selectivamente expresan CD137 aproximadamente 4 horas después de la activación, mientras las células-T convencionales solamente comienzan a expresar CD137 después de aproximadamente 12 a 16 horas. Aunque esta ventana de tiempo temprana se puede usar para aislar las células-T reguladoras solamente unas horas después de la activación, este método es propenso a errores y por lo tanto es de poco uso práctico. Una fuerte variabilidad en el estado de activación de las células-T después de obtenerlas a partir de la sangre o los tejidos así como también la variabilidad de la cinética especial de CD137 en las células-T individuales lleva a una contaminación de las células-T reguladoras con células-T convencionales, la cual puede ser pequeña o grande, en dependencia del momento del aislamiento, y la cual limita dramáticamente el uso de las células aisladas. Al usar un momento temprano para separar las células, la contaminación se puede mantener pequeña, aunque el rendimiento de las células-T reguladoras aisladas decrece extremadamente, a partir de que no todas las células-T reguladoras se convirtieron todavía a positivas para CD137. Como el número de células-T reguladoras, en particular de las células-T reguladoras específicas por el antígeno es pequeño para comenzar, la reducción del rendimiento disminuye el uso del método, a partir de que muchos usos terapéuticos no se pueden aplicar.

Por lo tanto, hasta la fecha, no es posible identificar y separar las células efectoras contaminantes (por ejemplo negativas para FoxP3 y/o positivas para citocinas) a partir de las células-T reguladoras (definidas por la expresión de marcadores conocidos, en particular CD25, CD25+CD127-, GITR+) o para diferenciar células-T reguladoras activadas por el antígeno de células-T convencionales activadas.

El término "células T convencionales" como se usa en la presente descripción se refiere a todas las células T las cuales no pertenecen a las células T reguladoras "de origen natural" las cuales se caracterizan por una expresión estable del factor de transcripción Foxp3+ y las cuales típicamente expresan CD25 constitutivamente y no o bajos niveles de CD127. Las células T convencionales especialmente se refiere a células T las cuales ejercen funciones efectoras activadoras inmunes, es decir producción de citocinas efectoras tales como IL-2, IFN-gamma, IL-4, IL-5, IL9, IL-17, IL-22.

Es así difícil, basado en el estado actual de la técnica, identificar y/o aislar las células-T reguladoras. Los marcadores descritos hasta ahora no permiten la posibilidad de identificar la totalidad de las células-T reguladoras, porque no todas las células-T reguladoras expresan marcadores específicos definidos. Por consiguiente, solamente es posible identificar y/o separar subpoblaciones, tales como, por ejemplo, solamente las Treg, las cuales expresan fuertemente el receptor CD25. Además, varias otras subpoblaciones celulares que tienen los mismos marcadores de superficie celular (tales como CD4 para Th1 y Th2, u otras células-Th o CD25 para células-T o B activadas) no se pueden distinguir de las células-T reguladoras.

Particularmente, no es posible identificar Treg activadas después de la estimulación con antígenos definidos por medio de marcadores de activación específicos. Aunque la activación de las células-Th reguladoras lleva al aumento de la expresión de CD25 y CD38, ellos se expresan igual que todos los otros marcadores... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de separación de células-T reguladoras activadas de una mezcla que comprende las células-T reguladoras activadas y células-T convencionales activadas al poner en contacto la mezcla de células con una molécula que se une a CD154 y la depleción de las células-T CD154+ de la mezcla y obtener así una población de células-T reguladoras activadas.

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas:

1) poner en contacto la mezcla de células con a) una molécula que se una al CD154 y la depleción de las células-T CD154+ de la mezcla; o b) una molécula que se une a un marcador para las células-T reguladoras o para las células-T reguladoras activadas y la selección positiva de las células que se unen a dicha molécula de unión. ;

2) poner en contacto a) las células de la etapa 1) a) con una molécula que se une al marcador para las células-T reguladoras o para las células-T reguladoras activadas y la selección positiva de las células que se unen a dicha molécula de unión y se obtiene así una población de células-T reguladoras activadas; o b) las células de la etapa 1) b) con una molécula que se une a CD154 y la depleción de las células-T CD154+ y se obtiene así una población de células-T reguladoras activadas.

3. Método de la reivindicación 2, en donde el marcador para las células-T reguladoras se selecciona del grupo de marcadores CD25 y GITR; y en donde el marcador para las células-T reguladoras activadas se selecciona del grupo de marcadores CD137, TGF-beta latente (LAP) , GARP (LRRC32) y CD121a/b.

4. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 en donde las moléculas que se unen a CD154 o a un marcador para las células-T reguladoras o para las células-T reguladoras activadas son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 en donde la mezcla que comprende las células-T reguladoras activadas y las células-T convencionales activadas se obtiene al estimular in-vivo las células-T.

6. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 en donde la mezcla que comprende las células-T reguladoras activadas y las células-T convencionales activadas se obtiene al estimular in-vitro las células-T.

7. Método de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 6 en donde las células se estimulan a través de sus antígenos específicos o por estímulo policlonal.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 6 en donde las células T reguladoras activadas se separan después y/o durante la estimulación de las células en la mezcla de células.

9. Método de acuerdo con cualquier reivindicación de procedimiento en donde la separación se lleva a cabo usando citometría de flujo o clasificación celular magnética.

10. Método de acuerdo con cualquier reivindicación de procedimiento en donde la molécula que se une a CD154 y/o la molécula que se une al marcador de células T para las células T reguladoras o para las células-T reguladoras activadas se acopla a un colorante fluorescente, un hapteno y/o una partícula magnética.

11. Kit para las células-T reguladoras activadas a partir de una mezcla que comprende las células-T reguladoras activadas y células-T convencionales activadas para proporcionar una población de células de las células-T reguladoras activadas, que comprende una molécula que se une a CD154 y una molécula que se une a un marcador para las células-T reguladoras activadas, en donde la molécula que se une a CD154 y la molécula que se une al marcador para las células-T reguladoras activadas son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se acoplan a colorantes fluorescentes, un hapteno y/o a una micropartícula magnética, y en donde el marcador para las células-T reguladoras activadas se selecciona del grupo de marcadores CD137, TGF-beta latente (LAP) , GARP (LRRC32) y CD121a/b.


 

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