Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

USO DE CARRAGENINA PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES POR RINOVIRUS.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen: Uso de ?-carragenina en una cantidad antivírica eficaz como principio activo antivírico en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por rinovirus.

Solicitante: MARINOMED BIOTECHNOLOGIE GMBH.

Nacionalidad solicitante: Austria.

Dirección: VETERINARPLATZ 1 GEBAUDE HA/3/STG. 3,1210 VIENNA.

Inventor/es: GRASSAUER, ANDREAS, PRIESCHL-GRASSAUER,EVA, MEIER,CHRISTIANE, PRETSCH,ALEXANDER.

Fecha de Publicación de la Concesión: 6 de Agosto de 2010.

Fecha Concesión Europea: 31 de Marzo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: A61K31/731 (...Carragenanos [7]).

Clasificación PCT: A61P31/16 (...para virus de la gripe o rinovirus [7]), A61K31/737 (...Polisacáridos sulfatados, p.ej. sulfato de condroitina, sulfato de dermatano (31/727 tiene prioridad) [7]), A61K31/731 (...Carragenanos [7]).

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Descripción:

Uso de carragenina para el tratamiento de infecciones por rinovirus.

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la inmunología y los agentes antivíricos y se refiere a una composición farmacéutica que comprende ?-carragenina como principio activo antivirico y a aplicaciones de esta en el tratamiento preventivo o terapéutico de las infecciones por rinovirus.

Antecedentes de la invención

Los picornavirus representan una familia vírica muy extensa de virus pequeños que contienen ácido ribonucleico, responsables de muchas enfermedades graves en seres humanos y animales. Los picornavirus incluyen cuatro grupos principales: enterovirus, rinovirus, cardiovirus y aftovirus.

Los rinovirus humanos constan de al menos 100 serotipos y son los agentes causantes primarios del resfriado común. Debido al elevado número de serotipos, es problemático el desarrollo de una vacuna; por lo tanto, la mejor estrategia de tratamiento puede ser el empleo de agentes antivíricos. Los rinovirus se componen de una cápsida envolvente que contiene cuatro proteínas víricas, VP1, VP2, VP3 y VP4. Las proteínas VPl, VP2 y VP3 están organizadas en 60 unidades protoméricas icosaédricas repetitivas. Se piensa que estas unidades son la causa de la diversidad antigénica asociada con estos virus.

Las infecciones por rinovirus (HRV) conducen al resfriado común con síntomas como fiebre, tos y congestión nasal. La infección por HRV es el segundo agente que se reconoce con mayor frecuencia asociado con la neumonía y la bronquiolitis en los bebés y niños pequeños, y normalmente causa agravamientos de enfermedades preexistentes de las vías respiratorias en aquellos con asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o fibrosis quística. La infección por HRV se asocia con de un tercio a la mitad de los agravamientos del asma dependientes de la edad y se halla ligada a las hospitalizaciones por asma tanto en adultos como en niños.

Las estrategias de tratamiento incluyen la administración de ARN especifico de rinovirus, como se describe en el documento DE 19825395, que se une a la región deprimida (cañón) de la cápsida, necesaria para la unión con el receptor del huésped (por ejemplo ICAM-1, molécula de adhesión intercelular 1) y la infección celular.

Otro procedimiento comprende la administración de proteínas ICAM-1 solubles o derivados de ICAM-1, como se describe en los documentos US 6.326.004 y US 6.096.862 (tICAM-1, ICAM-1 truncado) para neutralizar las partículas víricas (viriones).

Algunos compuestos químicos con actividad antivírica contra rinovirus se describen en el documento EP 0523803.

Los síntomas de los rinovirus están causados por una reacción excesiva o inespecífica del sistema inmunitario. Por lo tanto, las formas comunes de tratamiento de una infección por rinovirus incluyen la administración de analgésicos como aspirina o acetaminofeno/paracetamol, así como de versiones localizadas dirigidas a la garganta (administradas frecuentemente en forma de pastillas para chupar), descongestionantes nasales que reducen la inflamación en las vías nasales por constricción de los vasos sanguíneos locales, antitusivos (que funcionan suprimiendo el reflejo de la tos del cerebro o diluyendo el moco en los pulmones) y antihistamínicos de primera generación como bromofeniramina, clorofeniramina y clemastina (que reducen la secreción glandular de moco y, de este modo, combaten las narices bloqueadas o moqueantes pero que también pueden producir somnolencia).

Los polisacáridos sulfatados, incluyendo las carrageninas se conocen en la técnica por su eficacia antivírica. En una revisión de sumo interés, González M. E. y col. (1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31, 1388-1393) describen una eficacia antivírica de distintos polisacáridos sulfatados, incluyendo ?-carragenina, contra varios virus animales. El polisacárido ?-carragenina mostró actividad antivírica contra los virus con envuelta VHS-1, VHS-2, virus del bosque de Semliki (SFV), virus de la vaccinia y virus de la fiebre porcina africana (ASF) y contra el virus desnudo de la encefalomiocarditis (ECM). La ?-carragenina no tuvo efecto sobre los virus con envuelta de la estomatitis vesicular (VSV) ni del sarampión ni tampoco sobre el virus desnudo de la polio de tipo 1 ni el adenovirus de tipo 5.

El documento US 2003/181415 A describe la actividad antivírica de polisacáridos sulfatados, como sulfato de celulosa, contra diversos virus con envuelta y, en particular, contra el virus del herpes simple (VHS), los virus del papiloma y el VIH.

El documento WO 2005/004882 A describe el tratamiento terapéutico de infecciones víricas, excluyendo la infección por rinovirus, con polisacáridos sulfatados como las carrageninas.

El documento US 2005/171053 A1 describe el uso de ?-carragenina para inhibir la propagación de una infección de transmisión sexual, incluyendo la infección por VIH-1.

Yamada y col. (1997, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 32, 51-55) describen una actividad de ?-, ?- y ?-carragenina y sus derivados sulfatados contra el VIH-1.

S. F. Tischer y col. (2006, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 63, 459-465) describen una actividad de la carragenina aislada de Meristiella gelidium contra el virus del herpes simple y el virus del dengue.

Carlucci y col. (2004, Antiviral Research, Elsevier Science BV. 64, 137-141) describen un efecto protector de ?-carragenina en la infección genital por el virus del herpes simple en ratones.

Pujol y col. (2006, Planta Medica 72, 121-125) describen una actividad antivírica de una carragenina aislada de Gigartina skottsbergii contra la infección intraperitoneal por el virus del herpes simple murino.

El término "carragenina" se usa frecuentemente como un término colectivo para polisacáridos sulfatados lineales a base de galactosa extraídos de algas (rodoficeas). Se usa fundamentalmente como espesante, gelificante, estabilizante o emulsionante en productos farmacéuticos y alimentarios. Existen más de diez carrageninas diferentes, dependiendo del género de alga del que se extraen. Los tres tipos principales son ?-, ?- y ?-carragenina, que difieren ligeramente en cuanto a su estructura y grado de sulfatación. La ?-carragenina es un galactano sulfatado que forma un gel blando y que se extrae predominantemente de las algas rojas Gigartina stellata y Chondrus crispus. La ?-carragenina, producida predominantemente por Kappaphycus cottonii, produce geles rígidos y resistentes. La ?-carragenina que es la forma más común, se usa con frecuencia para el espesamiento de productos lácteos.

A pesar de que hace mucho tiempo que se conoce la actividad antivírica de algunas carrageninas contra virus como, por ejemplo, VIH o VHS, el mecanismo de cómo las carrageninas ponen de manifiesto la actividad antivírica necesita todavía clarificación.

A la luz de lo anterior, la presente invención proporciona ahora una composición antivírica a base de carragenina, adecuada para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infecciones por rinovirus (rinitis).

Sorprendentemente, los experimentos que conducen a la presente invención han demostrado que, a pesar de posibles reservas en la técnica, las carrageninas seleccionadas ejercen actividad antivírica contra infecciones por rinovirus (rinitis), siendo ?-carragenina la que produce los mejores resultados.

Descripción de la invención

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de ?-carragenina como un principio activo antivírico en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por rinovirus.

El término "principio activo antivírico" usado en este documento se refiere a un compuesto de carragenina que, cuando se administra en una dosis o cantidad eficaz, interfiere directa o indirectamente, o tanto directa como indirectamente, con el ciclo de la infección por rinovirus de una célula eucariota, más específicamente, con al menos una parte del ciclo de la infección por rinovirus, seleccionada del grupo que consta de la penetración del virus en una célula eucariota, la replicación del virus en una célula eucariota, el ensamblaje del virus y la liberación del virus de la célula eucariota infectada. También comprende cualquier efecto de inhibición inespecífica del aumento del título de un virus o de reducción inespecífica del título de un virus en un sistema huésped eucariota o mamífero. El término se refiere además a un compuesto que tiene eficacia profiláctica en el sentido de que protege, al menos en cierta medida, o reduce la probabilidad de sufrir una infección vírica.

Por lo tanto, la presente composición farmacéutica puede administrarse antes o después del inicio de una infección vírica. El término "profilaxis" o "tratamiento profiláctico", como se usa en este documento, se refiere a la administración de la presente composición farmacéutica con el fin de proteger, al menos en cierta medida, o de reducir el riesgo de enfermar por una infección vírica.

El término "terapia" o "tratamiento terapéutico", como se usa en este documento, se refiere a la administración de la presente composición farmacéutica a un individuo infectado por un virus con el fin de aliviar el impacto patológico de la infección, incluyendo una reducción de la gravedad y/o frecuencia de los síntomas que se presentan o la eliminación de dichos síntomas, la recuperación de las posibles lesiones causadas por, o asociadas con dicha infección vírica, e incluyendo la inhibición o prevención de una infección secundaria por virus, bacterias, hongos o cualquier otro tipo de microorganismo.

El término colectivo "carragenina" como se usa a partir de este momento se refiere a una mezcla de homo- o heteropolímeros de ?-carragenina y, opcionalmente, ?- y ?-carragenina, es decir, a una mezcla de homo- o heteropolímeros de ?- y ?-carragenina, de ?- y ?-carragenina o de ?-, ?- y ?-carragenina, a menos que se afirme explícitamente lo contrario o a menos que pueda derivarse un significado distinto del espíritu de la descripción pertinente.

Un homopolímero de ?-carragenina es un compuesto molecularmente puro de ?-carragenina. Un heteropolímero de carragenina comprende subunidades de al menos dos tipos de carrageninas diferentes, seleccionadas preferentemente del grupo que consta de subunidades de ?-, ?- y ?-carragenina; siendo ?-carragenina una de ellas.

Al referirse a partir de este momento al término "mezcla" de carrageninas, puede referirse también a la composición de un material que comprende como principio activo antivírico al menos un tipo de heteropolímero de carragenina, siendo la "mezcla" fundamentalmente, por lo tanto, una mezcla de distintas subunidades de carragenina, como parte de dicha, al menos una, carragenina heteropolimérica presente en la composición.

En otra realización, la invención se refiere a una composición antirrinovírica semejante para uso profiláctico o terapéutico, en que dicha infección por rinovirus es una infección por rinovirus aguda o crónica.

La presente composición a base de carragenina es adecuada para administración por vía tópica para el tratamiento de inflamaciones de la piel o las mucosas. Pero también es posible la administración por vía sistémica, por ejemplo, parenteral u oral, en particular cuando se adapta para contener fundamentalmente fracciones de carragenina de bajo peso molecular. La carragenina útil en la presente invención tiene un peso molecular medio en el intervalo de 15.000 a 5.000.000 Da. La fracción de bajo peso molecular comprende carragenina con un peso molecular medio en el intervalo de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 50.000, la fracción de peso molecular mediano, en el intervalo de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 500.000 Da y la fracción de alto peso molecular, en el intervalo de aproximadamente 500.000 a aproximadamente 5.000.000 Da.

En una realización preferida, la composición farmacéutica se adapta al uso tópico o sobre mucosas. Las formas galénicas adecuadas de las preparaciones listas para usar son cremas, geles, pomadas, polvos (incluyendo polvos para inhalación), esprays, espumas o disoluciones líquidas como lociones para la piel, disoluciones para gargarismos o gotas nasales. Otras formas adecuadas de preparación galénica serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los sistemas de administración de fármacos por vía nasal descritos en el documento US 6.391.452.

Además de los principios activos antivíricos, típicamente, la presente composición comprende al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros aditivos o principios activos.

Un vehículo adecuado puede ser un diluyente, por ejemplo, agua o disolución salina, un excipiente u otro vehículo adecuado y útil para la administración de los principios activos. Los aditivos opcionales pueden seleccionarse del grupo que consta de SiO2, TiO2, un aglutinante como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, gelatina, almidón, lactosa, monohidrato de lactosa, ácido alginico o maíz; un lubricante o tensioactivo como estearato de magnesio o laurilsulfato de sodio; un deslizante, como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante como sacarosa o sacarina. Otros aditivos en la preparación pueden ser, pero sin limitarse a estos, tampones o agentes de ajuste del pH seleccionados, por ejemplo, entre ácido cítrico, ácido acético, ácido fumárico, ácido clorhídrico, ácido málico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido propiónico, ácido sulfúrico, ácido tartárico o combinaciones de estos.

Otros principios activos pueden estar presentes, incluyendo fármacos distintos de carragenina o sustancias farmacéuticamente activas.

La carragenina puede usarse en forma de cualquier sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, pueden usarse sales de sodio de carragenina. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otras, sales de potasio, litio y amonio de carragenina.

En una realización preferida de la invención, la composición es para uso tópico y comprende ?-carragenina en una cantidad de entre el 0,01% y el 20%, preferentemente entre el 0,1% y el 10%, con la mayor preferencia entre el 0,5% y el 5% en peso (w/w) de la preparación.

Habitualmente, la composición se proporcionará como una preparación estéril no pirógena. En caso de una preparación líquida, la esterilidad puede conseguirse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de membrana adecuado. Los procedimientos para la preparación de composiciones farmacéuticas estériles o asépticas son bien conocidos en la técnica y no son parte de la presente invención.

Sin embargo, la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse también para recubrir superficies sólidas de artículos de higiene o sanitarios, por ejemplo, artículos para la higiene o el cuidado facial que se usan típicamente en las regiones oral y/o nasal, como pañuelos o toallitas de papel para la nariz y pañuelos de bolsillo. Más específicamente, la composición farmacéutica puede aplicarse, por ejemplo, pulverizarse, de manera muy similar a los desinfectantes, sobre guantes, pañuelos o toallitas papel higiénicos, incluyendo pañuelos de papel para la nariz, para ejercer un efecto víricida, al menos en cierta medida, contribuyendo, por lo tanto, a reducir la repetida autoinfección de un individuo por contaminación de las puntas de los dedos y a reducir también la propagación vírica entre individuos diferentes que están en estrecho contacto entre sí, por ejemplo, mano a mano. En función de la naturaleza del artículo sanitario o de higiene, dicho artículo puede estar cubierto, humedecido o impregnado de otra manera con la composición farmacéutica.

Tales artículos tratados con carragenina pueden incluir también, aunque sin restringirse a estos, bastoncillos de algodón, máscaras antipolvo o máscaras faciales. Incluso los lápices labiales pueden formularse de modo que contengan una cantidad antivírica eficaz de ?-carragenina. Estos artículos de higiene o cuidado sanitario pueden usarse profilácticamente o junto con un tratamiento terapéutico contra una infección vírica y pueden ser de ayuda en la prevención o reducción del riesgo de infección.

Por consiguiente, en una realización, la invención se refiere a un uso semejante, en el que la composición antivírica se aplica por recubrimiento o impregnación sobre la superficie sólida de un artículo de higiene o cuidado sanitario, en particular de un guante, toallita o pañuelo de papel de higiene o sanitario, especialmente un pañuelo o toallita de papel para la nariz.

Las carrageninas de los tipos ?, ? y ? útiles es la presente invención están disponibles en el comercio, pero pueden prepararse también por extracción a partir de algas, siguiendo los procedimientos de extracción conocidos en la técnica.

En su realización preferida, la invención se refiere al uso de los homo- y heteropolímeros de ?-carragenina, opcionalmente, con ?- y/o ?-carragenina.

En una realización especifica, la composición farmacéutica antivírica de la presente invención no contiene sustancialmente otras formas de carragenina además de ?- ?- y ?-carragenina, aunque pueden encontrarse presentes trazas de otras carrageninas. Para diversas aplicaciones, ?-carragenina puede ser sustancialmente el único tipo de carragenina presente en la composición.

En otra realización, la invención se refiere al uso de ?-carragenina en la preparación de una composición antivírica, en que la composición comprende además ?- o ?-carragenina o una mezcla de dichas carrageninas.

En otra realización, la invención se refiere a un uso tal, en el que la composición comprende no menos del 50%, no menos del 70%, no menos del 80% y, preferentemente, no menos del 95% (w/w) en peso seco de ?-carragenina, respecto al peso seco total de todas las carrageninas presentes en la composición. Los porcentajes se indican en porcentaje en peso (w/w) respecto al peso seco de todas las carrageninas presentes en la composición.

Los valores de concentración de carragenina anteriores se aplican de la misma manera a carrageninas homo- y heteropoliméricas.

Se ha encontrado que la carragenina no es tóxica en administración por vía oral o dérmica o por inhalación, incluso si se aplica a dosis extremadamente altas y, por lo tanto, ha sido clasificada como "generalmente reconocida como segura" (GRAS) por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los EE.UU.

En otra realización, la invención se refiere al uso de ?-carragenina en la preparación de una composición antivírica que comprende, además, al menos un compuesto antivírico y farmacéuticamente activo adicional, preferentemente sulfato de celulosa.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de ?-carragenina en la preparación de una composición farmacéutica para ejercer una función adyuvante antirrinovírica. Dicho, al menos otro compuesto o fármaco farmacéuticamente activo puede seleccionarse del grupo que consta de un esferoide, por ejemplo, cortisona y un antihistamínico.

En otra realización, la preparación farmacéutica antivírica es para el tratamiento o profilaxis en un individuo que es especialmente susceptible o se encuentra en riesgo incrementado de una infección por rinovirus, como un paciente de alto riesgo seleccionado del grupo formado por un paciente de asma, una persona con alergias y una persona que sufre una enfermedad inflamatoria.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de la muerte celular inducida por HRV (ensayo XTT).

Ordenadas = DO medida a 492 nm; abscisas = distintas muestras de ensayo; 1 = células sin infectar; 2 = células infectadas sin tratar; 3 = células infectadas tratadas con ?-carragenina; 4 = células infectadas tratadas con ?-carragenina; 5 = células infectadas tratadas con ?-carragenina; fig. 1A = células infectadas con HRV-2; fig. IB = células infectadas con HRV-14.

La fig. 2 muestra la determinación de los títulos máximos de los sobrenadantes de células HeLa infectadas en ensayos de DICT50.

Ordenadas = título DICT50; abscisas concentración de ?-carragenina en µg/ml; U = células sin tratar; T (tratamiento) = las células se infectaron durante una hora y la concentración indicada de ?-carragenina se añadió una hora después del tratamiento; P (profilaxis) = la suspensión vírica se preincubó con la concentración indicada de ?-carragenina durante una hora antes de la infección. El procesamiento posterior fue idéntico a T: las células se infectaron a una multiplicidad de infección de 0,01. Los títulos máximos se observaron el día 3 para HRV-2 (fig. 2A) y el día 4 para HRV-14 (fig. 2B).

La fig. 3 muestra la eficacia de ?-carragenina en la inhibición de la replicación del rinovirus en células de epitelio nasal humano infectadas, determinada por ensayos de DICT50.

Ordenadas = título DICT50 en logaritmos; abscisas - concentración de ?-carragenina en µg/ml; MOCK = células control sin tratar; fig. 3A = células infectadas con HRV-1A; fig. 3B = células.infectadas con HRV-2; fig. 3C = células infectadas con HRV-8; fig. 3D = células infectadas con HRV-16; fig. 3E = células infectadas con HRV-39; fig. 3F = células infectadas con HRV-83.

La fig. 4 muestra la eficacia de ?-carragenina contra rinovirus después del tratamiento repetido, determinada por ensayo de reducción del efecto citopático (EC).

Ordenadas = reducción del EC en %; abscisas = concentración de ?-carragenina en µg/ml; cepa HRV2P0 = cepa original de rinovirus (sin ciclo de replicación); cepa HRV2P10 = cepa de rinovirus HVR2P0 después de diez ciclos de replicación selectiva en células HeLa.

Con el fin de que la invención descrita en este documento pueda entenderse mejor se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen un propósito ilustrativo. Además, se entiende que la presente invención también comprenderá variaciones de las formas de realización descritas expresamente, en una medida que podría ser prevista por un experto en la técnica.

En los ejemplos, ?- y ?-carragenina solamente se usan con propósito comparativo.

Ejemplo 1

Efecto de diferentes tipos de carragenina contra el rinovirus humano de tipo 2 (HRV-2) y de tipo 14 (HVR-14)

Se incubaron células HeLa subconfluentes con una suspensión vírica preincubada durante 5 minutos con 125 µg/ml de los polímeros como se indica en la figura 1. Después de 48 horas se determinó la viabilidad de las células con el ensayo TOX2 XTT (Sigma).

Como se muestra en la figura 1, se encontró que el polímero más efectivo fue ?-carragenina (columna 3), que fue efectivo contra ambos tipos de rinovirus, mientras que ?-carragenina (columna 5) y ?-carragenina (columna 4) mostraron eficacia contra HRV-2 pero no contra HRV-14. Las barras de error indican la desviación estándar entre seis pocillos independientes.

Ejemplo 2

Los polímeros indicados en la tabla 1 se analizaron en un ensayo de inhibición de la muerte celular inducida por HRV-2 y HRV-14 (ensayo XTT) a una concentración de 100 µg/ml.

Como se muestra en la tabla 1, ?-carragenina ofreció protección contra los dos tipos de rinovirus (un signo "+" indica al menos el 95% de protección en comparación con las células control sin infectar). Las carrageninas de tipo ? y ? fueron activas contra HRV-2, pero no contra HRV-14. Los polímeros quitosano, carboximetilcelulosa y carboximetilquitosano no mostraron ningún efecto inhibidor en absoluto.

TABLA 1 Actividad antivírica de varios polímeros analizados

Ejemplo 3

La ?-carragenina fue eficaz contra HRV-2 y HRV-14 en un modelo de tratamiento y de profilaxis contra la replicación vírica. Se observó una reducción significativa del título vírico máximo a concentraciones iguales o superiores a 6,25 µg/ml. Sin embargo, ?-carragenina presentó la máxima efectividad en el modelo de profilaxis contra HRV-2, en que se observó una reducción de más del 99,9% en el título vírico máximo.

Ejemplo 4

Efecto de ?-carragenina contra una selección de subtipos de rinovirus humanos

Se incubaron células HeLa subconfluentes en placas de 96 pocillos con una suspensión vírica a una MDI (multiplicidad de infección) de 0,5. Veinte minutos después de la infección con la suspensión vírica se añadió un medio nutriente que contenía el polímero en diluciones 1:3. Después de 48-72 horas se determinó la viabilidad de las células con el ensayo TOX2 XTT (Sigma). Los valores de CE50 se calcularon con el programa informático Excel-Fit.

TABLA 2

La ?-carragenina fue activa contra todos los rinovirus humanos analizados en células HeLa previamente infectadas. Las concentraciones de carragenina necesarias para inhibir el 50% del efecto citopático varían en un amplio intervalo desde <0,5 µg/ml para HRV-8 a 400 µg/ml para HRV-14. Este resultado indica que ?-carragenina inhibe la replicación de una amplía gama de subtipos de rinovirus en células HeLa infectadas.

Ejemplo 5

Inhibición por ?-carragenina de la replicación de rinovirus en células de epitelio nasal humano

Células primarias de epitelio nasal humano (Promocell) se sembraron en placas de 24 pocillos (2,9•104 células por pocillo) y se cultivaron durante tres días a 37ºC, con el 5% de CO2 y el 95% de humedad. Las células se infectaron a una confluencia cercana al 60% con las cepas de rinovirus HRV-1A, HRV-2, HRV-8, HRV-14, HRV-16, HRV-39, HRV-83 y HRV-84. Los rinovirus HRV-1A, HRV-2, HRV-8, HRV-16, HRV-39 y HRV-83 llevaron a cabo una replicación lítica en las células de epitelio nasal humano. Los rinovirus HRV-14 y HRV-84 no lisaron las células y, por lo tanto, no se sometieron a ensayos posteriores. Los virus se preincubaron con ?-carragenina a concentraciones de 4, 40 y 400 µg/ml y un control simulado (MOCK). La MDI fue de 0,34. Los sobrenadantes se recogieron entre 48 y 72 horas después de la infección y se usaron para la determinación del título DICT50.

Como se muestra en la figura 3, el tratamiento con ?-carragenina a una concentración de 40 µg/ml redujo al menos dos valores logarítmicos el título vírico de todos los virus en los sobrenadantes (>99%) en comparación con las células de control con tratamiento simulado (MOCK) (el eje Y muestra el título vírico en logaritmos). Estos datos demuestran claramente que ?-carragenína inhibe la replicación del virus en células primarias de epitelio humano. Dado que parece que por el momento no hay ningún modelo animal disponible para el ensayo in vivo de los rinovirus humanos, las células de epitelio nasal humano usadas en esta invención representan el modelo in vitro más importante de que se dispone en la actualidad. Las barras de error indican la desviación estándar entre tres muestras analizadas independientes.

Ejemplo 6

Determinación de la eficacia de ?-carragenina contra la infección por rinovirus después del tratamiento repetido (análisis del posible desarrollo de resistencia vírica)

El virus original HRV2P0 y el virus HRV2P10, obtenido después de diez ciclos de replicación selectiva en células HeLa se analizaron en un ensayo de reducción del EC (efecto citopático). Las células HeLa (8•104 células por pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos. Las células se infectaron con un medio nutriente adecuado, suplementado con el polímero de carragenina a concentraciones finales de carragenina de 1,6, 5,3, 17, 50, 150 y 450 µg/ml y que contenía además el virus a una MDI de 0,1.

Como controles, un pocillo sufrió una infección simulada (MOCK) con medio nutriente suplementado con carragenina y sin virus y otro pocillo se infectó con una suspensión vírica sometida a tratamiento simulado (MOCK), es decir, una suspensión vírica que contenía medio nutriente, pero sin carragenina. Después de un tiempo de incubación de 20 minutos tras la infección, las placas se lavaron dos veces y se añadió medio de control (sin virus y suplementado con carragenina a las concentraciones seleccionadas) a todos los pocillos, excepto al control negativo con tratamiento simulado (es decir, infección pura, sin inhibición). Se tomaron muestras de cada pocillo experimental en el momento en que se hizo visible un claro efecto citopático en el pocillo del control negativo sin proteger. Para el siguiente ciclo de selección, los sobrenadantes con virus, tomados de aquellos pocillos tratados con carragenina que exhibían un EC claramente detectable respecto al control sin infectar, se usaron para la infección de células HeLa. Típicamente, solo pudieron detectarse respuestas de EC en las muestras experimentales correspondientes a las dos concentraciones inferiores de carragenina, es decir, 1,6 y 5,3 µg de carragenina por 1 ml.

El procedimiento se repitió diez veces y las muestras de virus resultantes se compararon en un ensayo de inhibición del EC con el virus madre original. Brevemente, 48 horas después de la infección se añadió un reactivo TOX2 (Sigma), se determinaron los valores de DO450nm y se determinó la reducción del EC en % respecto al control sin infectar.

Con el fin de analizar el posible desarrollo de resistencia vírica contra el tratamiento con carragenina, el virus usado para la primera inoculación (virus 2_001 en la fig. 4) y un virus obtenido después de diez ciclos de replicación selectiva (virus 20_001 en la fig. 4) se analizaron en un ensayo de reducción de EC usando células HeLa y siguiendo un protocolo experimental ligeramente diferente del descrito anteriormente. Brevemente, las células HeLa se infectaron con el virus respectivo a un MDI de 0,1 y 20 minutos después de la infección se retiró el inóculo y se añadió medio nutriente con el polímero de carragenina a concentraciones finales de 1,6, 5,3, 17, 50, 150 y 450 µg/ml (véase el eje de abscisas de la fig. 4). A las 48 horas después de la infección se añadió un reactivo TOX2 (Sigma), se determinaron los valores de DO450nm y se determinó la reducción del EC en % respecto al control sin infectar (fig. 4, ordenadas). Las barras de error indican la desviación estándar entre seis pocillos independientes.

Como se representa gráficamente en la figura 4, no se detectó una diferencia significativa en la susceptibilidad del virus frente al tratamiento con carragenina en las muestras obtenidas del sobrenadante del primero y del décimo ciclo de infección. Esto indica que no se originaron mutantes de escape durante el proceso de selección. Por lo tanto, estos datos sugieren que puede ser improbable que se produzca un escape de rinovirus durante la terapia in vivo con ?-carragenina, incluso en casos de terapia continuada o repetida durante un periodo de tiempo prolongado.

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se ha incluido solamente para información del lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que dicha lista se ha elaborado con el mayor cuidado, no es posible excluir errores u omisiones eventuales, por los que la OEP no asume ninguna responsabilidad.

Documentos de patente citados en la descripción

• DE 19825395• US 2003181415 A • US 6326004 B• WO 2005004882 A • US 6096862 A• US 2005171053 A1 • EP 0523803 A• US 6391452 B

Bibliografía citada en la descripción que no corresponde a patentes

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• Pujol y col. Planta Medica, 2006, vol. 72, 121-125.




Reivindicaciones:

1. Uso de ?-carragenina en una cantidad antivírica eficaz como principio activo antivírico en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por rinovirus.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha infección por rinovirus es una infección por rinovirus aguda o crónica.

3. El uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la composición se adapta al uso tópico o sobre mucosas, preferentemente para el uso como un espray nasal, un polvo, incluyendo un polvo para inhalación, un gel, una pomada, una espuma o una disolución líquida, en particular, una loción, una disolución para gargarismos o gotas.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición comprende además al menos un vehículo o aditivo farmacéuticamente aceptable.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la composición se adapta al uso tópico y comprende ?-carragenina en una cantidad entre el 0,01% y el 20%, preferentemente entre el 0,1% y el 10%, con la máxima preferencia entre el 0,5% y el 5% (w/v) de la preparación.

6. El uso según una cualquiera de las referencias 1 a 5, en el que la composición comprende además al menos otra carragenina, seleccionada entre ?-carragenina y ?-carragenina.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición comprende no menos del 50%, opcionalmente no menos del 80% y preferentemente no menos del 95% (w/w) en peso, de ?-carragenina respecto al total de todas las carrageninas presentes en la composición.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que la composición comprende además al menos otro componente antivírico farmacéuticamente activo.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composición se usa para recubrir una superficie sólida de un artículo de higiene o cuidado sanitario, particularmente de un guante, pañuelo o toallita de papel de higiene o sanitario, en particular un pañuelo o toallita de papel la nariz.

10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la composición comprende además al menos otro compuesto farmacéuticamente activo, preferentemente un esferoide o un antihistamínico.

11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha infección por rinovirus afecta a un individuo que es un paciente de alto riesgo, seleccionado del grupo formado por un paciente de asma, una persona que sufre alergia y una persona que sufre una enfermedad inflamatoria.

12. Artículo de higiene o sanitario sólido recubierto o impregnado con una composición antivírica, a la que se refiere en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Artículo de higiene o sanitario sólido según la reivindicación 12, en que el artículo se selecciona del grupo que consta de guantes, pañuelos de papel higiénicos, toallitas de papel higiénicas, artículos de higiene facial y artículos para el cuidado sanitario facial usados en las regiones oral y/o nasal, en particular pañuelos o toallitas de papel para la nariz y pañuelos de bolsillo.

14. El compuesto ?-carragenina para usar en una cantidad antivírica eficaz como principio activo antivírico en una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por rinovirus.

15. El compuesto ?-carragenina para usar según la reivindicación 14, en el que la composición se adapta al uso tópico y comprende ?-carragenina en una cantidad entre el 0,01% y el 20%, preferentemente entre el 0,1% y el 10%, con la máxima preferencia entre el 0,5% y el 5% (w/v) de la preparación.






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