Unión a glicosaminoglicanos de proteínas con dominio SECRET codificadas por poxvirus.

La presente invención hace referencia al uso de un dominio SECRET de proteínas con dominio SECRET codificadas por poxvírus (CrmB,

CrmD, SCP-1, SCP-2 y SCP-3), sus homólogos funcionales, derivados o fragmentos, capaces de unirse a glicosaminoglicanos (GAGs) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias, caracterizado porque dicho dominio SECRET se selecciona de entre una de las siguientes secuencias: SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 26, y SEQ ID N° 28. La presente invención también protege el uso de dicho medicamento para incrementar la estabilidad y/o las propiedades inmunomoduladoras de una proteína seleccionada entre: CrmB, CrmD, SCP-1, SCP-2 y SCP-3, así como su fusión a un vTNFR, o a un anticuerpo humanizado anti-TNF.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Esta invención se refiere a la capacidad de unir glicosaminoglicanos (GAG s) del dominio de unión a quimioquinas SECRET (smallpox virus-encoded chemokine receptor) presente en los receptores del factor necrosante de tumores (TNFRs) denominados cytokine response modifier B y D (CrmB y CrmD) y en las proteínas denominadas SECRET-containing proteins 1, 2 Y 3 (SCP-1, SCP-2 y SCP-3) codificadas por poxvirus, y por homólogos, derivados o fragmentos de estos, para incrementar las propiedades inmunomoduladoras de las proteínas con dominio SECRET. También se refiere a polipéptidos de fusión, composiciones farmacológicas y a ensayos que utilicen las proteínas de la invención.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las citoquinas, como parte importante en la regulación de una respuesta anti-viral efectiva, constituyen la forma de comunicación entre los componentes celulares encargados de acabar con la infección. La convivencia con el hospedador a lo largo de años de evolución ha permitido a los poxvirus captar genes de sus hospedadores para adaptarlos en su propio beneficio. Así, estos virus son capaces de expresar versiones virales solubles de receptores (viroceptores) o de citoquinas (viroquinas) con el fin de manipular la regulación de la respuesta anti-viral para garantizar su expansión en el organismo. Al mismo tiempo, los poxvirus expresan proteínas sin similitud de secuencia con algún componente celular conocido pero con funciones específicas de unión e inhibición de citoquinas (Alcami, 2003) .

El factor de necrosis tumoral a (TNFa) se activa poco después de que un virus infecte a su hospedador para poner en marcha la respuesta mediante la inducción de quimioquinas (CKs) , moléculas de adhesión y otras citoquinas y regulando o tomando parte en los mecanismos efectores de las células del sistema inmunológico para eliminar las células infectadas lo antes posible. Es una molécula esencial para el establecimiento de una respuesta celular, o Th1, efectiva frente a una infección viral y, por ello, los poxvirus han adoptado elegantes estrategias para bloquear esta citoquina (Cunnion, 1999) .

La expresión de homólogos solubles de los receptores celulares del TNFa (vTNFRs) , es una de estas estrategias virales. Hasta la fecha se han descrito cuatro vTNFRs diferentes, los modificadores de la respuesta de citoquinas B (CrmB) , CrmC, CrmD y CrmE. Las distintas especies de poxvirus expresan de manera diferencial estos vTNFRs. CrmB y CrmD, a diferencia de CrmC y CrmE, contienen un dominio C-terminal que inhibe la actividad in vitro de algunas CKs. Este dominio fue descrito por primera vez en nuestro laboratorio y se denominó SECRET por §.mallpox virus ~ncoded g, hemokine receptor. Así, CrmB y CrmD poseen una doble actividad, anti-TNFa y anti-CKs. Además, el dominio SECRET forma parte también de 3 proteínas secretadas codificadas por poxvirus, denominadas SECRET domain-containing proteins 1, 2 Y 3 (SCP-1, SCP-2 Y SCP-3) (Alejo y cols. 2006) . Los genes que codifican los dominios SECRET se encuentran en el virus vaccinia (VACV) , virus ectromelia (ECTV) , virus cowpox (CPXV) o virus de la viruela (VARV) .

En la clínica existen receptores solubles del factor necrosante de tumores (TNF) y anticuerpos monoclonales humanizados anti-TNF para el tratamiento de alteraciones inflamatorias.

La patente ES 2315037 describe el uso del dominio C-terminal (CTD) de los receptores del factor necrosante de tumores (TNFR) codificados por poxvirus y denominados "cytokine response modifier B y D" (CrmB y CrmD) , y por homólogos, derivados o fragmentos de estos para modular la actividad de las quimioquinas y para incrementar las propiedades inmunomoduladoras de los TNFRs. También se refiere a polipéptidos de fusión, composiciones farmacológicas y a ensayos que utilicen las proteínas de la invención. Esta invención protege el uso de un nuevo dominio de unión a quimioquinas (denominado SECRET) , presente en poxvirus, para aumentar la capacidad anti-inflamatoria de los TNFRs que se utilizan en la clínica como medicamento anti-inflamatorio.

Los glicosaminoglicanos (GAG s) son polisacáridos unidos a un núcleo proteico con un alto grado de sulfatación y carga. Se encuentran en la superficie celular y en la matriz extracelular y participan en importantes procesos biológicos como son la proliferación celular, morfogénesis, migración, patogénesis viral y unión de factores de crecimiento y citoquinas (Handel y cols., 2005) . Por ejemplo, la unión de CKs a los GAGs es fundamental en la formación de gradientes quimiotácticos que guían la migración linfocitaria (Proudfoot y cols., 2003) .

Algunas proteínas de modulación inmunológica de poxvirus, como el receptor soluble de interferón de VACV, B18 (Montanuy y cols., 2011) , o el ortólogo de A41 en ECTV, E163 (Ruiz-Arguello y cols., 2008) , son capaces de unirse a la superficie celular mediante la interacción con GAGs. De esta manera, consiguen aumentar su concentración local entorno a los receptores de las citoquinas con las que interaccionan. Al tratarse de una estrategia extendida entre las proteínas de modulación inmunológica de poxvirus, se ha estudiado la posible unión de CrmD a estos polisacáridos de superficie. A este respecto, se ha descubierto que CrmD, a través de su dominio SECRET, es capaz de interaccionar con GAGs con alta afinidad y bloquear el efecto del TNFa en las superficies celulares.

El TNFa se encuentra detrás de la patogénesis de numerosos trastornos inflamatorios sufridos por millones de personas en todo el mundo. Enfermedades como la artritis reumatoide, psoriasis, vasculitis, artritis crónica juvenil, espondilitis anquilosante o la enfermedad de Crohn están siendo tratadas mediante inhibidores del TNFa con cierto grado de éxito (Wong y cols., 2008) .

Hoy en día existen cinco medicamentos aprobados para la clínica: Etanercept, adalimumab, infliximab, certolizumab y golimumab (Tak y Kalden, 2011) . Todos, excepto etanercept, consisten en la aplicación de anticuerpos anti-TNFa de distinta naturaleza. Etanercept es una versión soluble de un dímero del TNFR2 fusionado a una porción Fc de una IgG humana. Etanercept, adalimumab y infliximab son los tratamientos más extendidos entre la población mundial con 500.000, 370.000 Y 1.136.000 pacientes respectivamente (Tak y Kalden, 2011) .

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención demuestra que el dominio SECRET, además de inhibir quimioquinas, se une a la superficie celular a través de glicosaminoglicanos (GAGs) . De esta manera, gracias a este dominio SECRET los TNFRs virales pueden incrementar su concentración local en torno a los receptores celulares de sus ligandos y así llevar a cabo sus funciones inhibitorias de manera más eficaz.

Los TNFRs solubles utilizados en clínica, para mejorar su estabilidad, están fusionados a una porción Fc de inmunoglobulinas humanas, de lo que sin embargo se pueden derivar efectos secundarios adversos como resultado de la activación del sistema del complemento. Esta fusión a la porción Fc permite el transporte de los TNFRs por el torrente sanguíneo unidos a los receptores celulares de regiones Fc. La fusión del dominio SECRET a estos TNFRs, llevaría a estos inhibidores del TNF a la superficie celular, donde verían aumentada su concentración local y estabilidad, pudiendo transportarse unidos a los GAGs de superficie pero sin activar el sistema del complemento.

La presente invención identifica una nueva propiedad del dominio SECRET no descrita en otras patentes relacionadas, para el desarrollo de terapias anti-TNF más eficaces y con menores efectos adversos. Esta propiedad de unirse a GAGs de superficie se podría incorporar a los TNFRs humanos utilizados en la clínica.

Esta nueva propiedad del dominio SECRET, hace que este domino de receptores de TNF virales pueda ser fusionado a receptores solubles utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias, como es el caso de los. medicamentos anti-TNF, para llevar a estos inhibidores a la superficie celular. De esta manera se consigue un medicamento de mayor estabilidad y acción a nivel local.

La presente invención se refiere a la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET de los vTNFRs CrmB

o CrmD y SCPs (SCP-1, SCP-2 y SCP-3) , incluyendo homólogos funcionales, derivados y fragmentos de todos ellos para incrementar las estabilidad y las propiedades inmunomoduladoras de estas proteínas.

La presente invención se refiere también a la capacidad de unión a GAG s del dominio SECRET de los vTNFRs CrmB o CrmD y SCPs (SCP-1, SCP-2 Y SCP-3) , incluyendo homólogos funcionales, derivados y fragmentos de todos ellos para incrementar las estabilidad y las propiedades... [Seguir leyendo]

1. Uso de un dominio SECRET de una proteína seleccionada entre: CrmB, CrmD, SCP-1, SCP-2 y SCP-3, su homólogo funcional, derivado o fragmento, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias, caracterizado por que dicho dominio SECRET es capaz de unirse a GAGs y se setecciona de entre una de tas siguientes secuencias: SEa ID N° 6, SEa ID N° 8, SEa ID N° 14, SEa ID N° 16, SEa ID N° 18, SEa ID N° 20, SEa ID N° 22, SEa ID N° 24, SEa ID N° 26, Y SEa ID N° 28.

2." Uso segun la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio SECRET de CrmB, su homólogo funcional, derivado o fragmento es SEa ID N° 26 o SEa ID N° 28.

3." Uso segun la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio SECRET de CrmO, su homólogo funcional, derivado o fragmento es SEa ID N° 22 o SEa ID N° 24.

4." Uso segun la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio SECRET de SCP-1, SCP-2 y SCP-3, su homólogo funcional, derivado o fragmento !ie selecciona de entre una de las siguientes secuencias: SEa ID N° 6, SEa ID N° 8, SEa ID N° 14, SEa ID N° 16, SEa ID N° 18 Y SEa ID N° 20.

5." Uso segun las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que el homólogo funcional del dominio SECRET tiene al menos un 80% de homología de secuencia de aminoácidos.

6." Uso segun las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que dicho medicamento incrementa la estabilidad y/o las propiedades inmunomoduladoras de al menos una proteina seleccionada entre: CrmB, CrmO, SCP-1, SCP-2 y SCP-3.

7. Uso segun las reivindicaciones 1-6, caracterizado por que el dominio SECRET, su homólogo funcional, derivado o fragmento está fusionado al menos a un vTNFR, o a un anticuerpo humanizado anti-TNF.

8. Uso segun la reivindicación 7, caracterizado por que el dominio SECRET, su homólogo funcional, derivado o fragmento está fusionado al dominio N-terminal de unión a TNF del vTNFR.

9. Uso segun la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que el vTNFR es CrmB o CrrnO.

10. Uso según las reivindicaciones 7-9, caracteri¡~ado por que el vTNFR es de origen humano.

11. Uso según las reivindicaciones 1-10, C::lracterizado por que el medicamento comprende un inmunosupresor o una suslancia anti-inflamatoria adicional.

12. Uso segun las reivindicaciones 1-11, caracterizado por que el medicamento comprende al menos un anticuerpo especifico inhibidor de la capacidad de unión a GAGs del dominio SECRET.