Un método para regular la expresión génica.

Un método para inhibir la expresión de un gen que comprende introducir en una célula vegetal o en una célula humana o animal no humana aisladas una construcción de ADN que comprende un promotor constitutivo o inducible funcional en dicha célula unido de forma funcional a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, como parte de una secuencia codificada más larga, un precursor de miARN, comprendiendo dicho precursor de miARN una estructura de tronco-bucle y comprendiendo en dicho tronco de dicha estructura de troncobucle una secuencia complementaria a una parte de un transcrito de ARN de dicho gen, donde dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle tiene una longitud de aproximadamente 19-45 pares de bases y el bucle de dicha estructura de tronco-bucle comprende aproximadamente 4-25 nucleótidos,

donde, después de la introducción de dicha construcción en dicha célula:

(i) se transcribe dicha secuencia de nucleótidos,

(ii) el transcrito resultante de dicha secuencia de nucleótidos se procesa de modo que dicho precursor de miARN se escinde de dicho transcrito de dicha secuencia de nucleótidos,

(iii) dicho precursor de miARN se procesa de modo que un miARN maduro de aproximadamente 21 o 22 nucleótidos de longitud se escinde de dicho precursor de miARN, y

(iv) se realiza la inhibición de la expresión de dicho gen.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/013923.

Solicitante: DUKE UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: OFFICE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, P.O. BOX 90083 DURHAM, NC 27708-0083 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CULLEN,B.R, ZENG,YANG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/11 (Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES... > Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales... > A01N43/04 (con un heteroátomo)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/07 (Compuestos del retinol, p. ej. la vitamina A (ácidos retinoicos A61K 31/203))

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Fragmento de la descripción:

Un método para regular la expresión génica

Campo técnico

La presente descripción se refiere, en general, a la expresión génica y, en particular, a un método para inhibir la expresión de un gen diana, a construcciones adecuadas para su uso en dicho método y a plantas y animales no humanos que comprenden dichas construcciones. La descripción también se refiere a composiciones y kits que comprenden construcciones que pueden usarse para inhibir la expresión génica.

Antecedentes Se ha demostrado recientemente que las células animales expresan una nueva clase de ARN no codificantes monocatenarios, de !22 nucleótidos (nt) , llamados micro ARN (miARN) (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001) ; Lau et al, Science 294:858-862 (2001) ; Lee y Ambros, Science 294:862-864 (2001) ) . Los miARN parecen derivar de precursores de !70 nt que forman una estructura de tronco-bucle de ARN predicha. Sigue sin estar claro si estas moléculas precursoras de miARN se transcriben a partir de promotores autónomos o en su lugar están contenidos dentro de ARN más largos (Ambros, Cell 107:823-826 (2001) ; Lau et al, Science 294:858-862 (2001) ) .

Aunque se expresan más de 100 miARN distintos en organismos tan diversos como nematodos (Lau et al, Science 294:858-862 (2001) , Lee et al, Science 294:862-864 (2001) ) , moscas de la fruta (Lagos-Quintana et al, Science 294 858-858 (2002) , y seres humanos (Mourelatos et al, Genes Dev. 16:720-728 (2002) ) , así como en plantas (Tang et al, Genes Dev. 17:49-63 (2003) , Reinhart et al, Genes Dev. 16:1616-1626 (2002) ) , su función sigue siendo en gran medida incierta. Sin embargo, la actividad biológica de dos miARN, let-7 y lin-4 de C. elegans, están bien establecidas (Lee et al, Cell 75:843-854 (1993) ; Reinhart et al, Nature 403: 901-906 (2000) ) . Tanto lin-4 como let-7 se expresan durante fases larvarias específicas y ambos miARN interaccionan con dianas de ARN parcialmente complementarias, localizadas en la región no traducida 3' (3' UTR) de ARNm específicos, para bloquear de forma selectiva su traducción. Esta inhibición es importante para una regulación apropiada del desarrollo en C. elegans (Wightman et al, Cell 75:855-862 (1993) ; Slack et al, Mol. Cell 5:659-669 (2000) ) .

Varios miARN, incluyendo let-7, están evolutivamente conservados de C. elegans a seres humanos, como varias dianas de let-7 (Ambros, Cell 107:823-826 (2001) ) . Esta conservación implica que let-7, así como otros miARN, también reprimen la expresión de especies específicas de ARNm en células de mamífero. Esta hipótesis también se sugirió por la similitud entre los miARN y pequeños ARN interferentes (ARNip) , ARN bicatenarios de !21 nt que pueden inducir la degradación de moléculas de ARNm que contienen dianas complementarias perfectamente apareadas, un proceso llamado interferencia de ARN (iARN) (revisado por Sharp, Genes Dev. 15:485-490 (2001) , véase también Hutvagner et al, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:225-232 (2002) y Zamore et al, Science 296:1265-1269 (2002) , véase adicionalmente el documento USP 6.506.559) . Sin embargo, aunque los miARN se codifican dentro del genoma hospedador, los ARNip se escinden generalmente de precursores de ARNbc más grandes producidos durante infección vírica o introducidos de forma artificial.

Como la introducción de ARNip artificiales en células animales puede inducir la degradación de moléculas homologas de ARNm, la iARN ha surgido como herramienta experimental útil (Elbashir et al, Nature 411:494-498 (2001) ; Fire et al, Nature 391:806-811 (1998) ; Hammond et al, Nature 404:293-295 (2000) ) . Sin embargo, en células de mamífero, la inducción de iARN requería para la transfección de oligonucleótidos de ARN, que puede ser ineficaz y dar lugar a una inhibición solamente transitoria en la expresión del gen diana.

La presente descripción proporciona moléculas de ARN (miARN) funcionalmente equivalentes a ARNip que pueden transcribirse de forma endógena en células animales y vegetales. La invención hace posible la producción de miARN diseñados específicamente para inhibir la expresión de ARNm que contiene una secuencia diana complementaria. Las moléculas de miARN de la descripción pueden usarse de forma experimental o terapéutica para inhibir la función génica.

Sumario de la invención La presente descripción se refiere a miARN artificiales y a un método para usar los mismos para inhibir específicamente la expresión de genes seleccionados en células animales humanas y no humanas y en células vegetales. De acuerdo con la descripción, se introduce una secuencia de ADN que codifica un miARN en las células y se induce la inhibición del gen diana mediante miARN transcritos de forma endógena. Cuando resulta ventajoso, la transcripción del miARN puede situarse bajo el control de un promotor inducible o un promotor específico de tejido. Como el presente método puede provocar una producción continua de miARN, puede realizarse una inhibición estable de la expresión del ARNm diana.

Quedarán claros los objetivos y las ventajas de la presente invención a partir de la siguiente descripción.

Breve descripción de los dibujos Figuras 1A-1B. Producción del miARN miR-30 en células transfectadas. (Fig. 1A) Diagrama del ARN precursor miR-30 humano predicho (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001) ) . Se indican con líneas el miR-30 maduro (brazo 3') y anti-miR-30 (brazo 5') . Las flechas apuntan a los extremos 5' del miARN maduro determinados por análisis de extensión de cebador. La posición de los extremos 3' puede contener un error de 1 nucleótido. (Fig. 1B) Análisis de transferencia de Northern de miR-30 y anti-miR-30 en células 293T transfectadas. Carriles 1 y 4: ARN de células 293T transfectadas de forma simulada. Carriles 2 y 5: células transfectadas con pCMV-miR-30. Carriles 3 y 6: células transfectadas con pCMV-mmiR-30 (mmiR=miR maduro) . Se indica la movilidad relativa de oligos de ADN sintéticos. "*" indica la posición de una especie sospechosa antimiR-30 endógena.

Figuras 2A-2C. El miARN miR-30 inhibe de forma selectiva la expresión de un ARNm indicador que contiene sitios diana de miR-30. (Fig. 2A) La presencia de un sitio diana diseñado parcialmente complementario a miR-30. pDM128/RRE/4XT se obtuvo de pDM128/RRE por inserción de cuatro copias de este sitio diana en el 3' UTR (recuadros negros) . Se indican los sitios de corte y ayuste (ss) , el RRE y la posición relativa de la sonda RPA. (Fig. 2B) Las células 293T se co-transfectaron, con 10 ng de un plásmido de control interno (pBC12/CMV/∀-gal) que expresaba ∀-galactosidasa (∀-gal) y, como se indica, 10 ng de pDM128/RRE o pDM128/RRE/4XT, 10 ng pcRev, y 400 ng of pC-MV-mmiR-30 o pCMV-miR-30. El plásmido parental pBC12/CMV sirvió como control negativo. Se determinaron las actividades CAT a las 48 horas tras la transfección y se normalizaron por las actividades ∀-gal. Las columnas 2 y 6 se establecieron arbitrariamente al 100 %. (Fig. 2C) Las células 293T se transfectaron con el plásmido pDM128/RRE/ 4XT, con o sin pcRev o pCMV-miR-30, como se describe en la Fig. 2B. A las 48 horas después de la transfección, las células se dividieron en las fracciones nuclear (N) y citoplasmática (C) , se aisló el ARN total y se analizó por RPA. Se indican los fragmentos de sonda rescatados por los ARNm con corte y ayuste (S) y sin corte y ayuste (U) codificados por pDM128/RRE/4XT.

Figuras 3A-3D. El nuevo miARN miR-30-nxt inhibe específicamente la expresión citoplasmática de ARNm de pgTAT-nxt sin corte y ayuste. (Fig. 3A) Diseño del precursor del miARN miR-30-nxt. Se indican las secuencias insertadas derivadas del gen nxt global de Drosophila. (Fig. 3B) Detección de los nuevos miARN miR-30-nxt y anti-miR-30-nxt en células... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para inhibir la expresión de un gen que comprende introducir en una célula vegetal o en una célula humana o animal no humana aisladas una construcción de ADN que comprende un promotor constitutivo o inducible funcional en dicha célula unido de forma funcional a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, como parte de una secuencia codificada más larga, un precursor de miARN, comprendiendo dicho precursor de miARN una estructura de tronco-bucle y comprendiendo en dicho tronco de dicha estructura de troncobucle una secuencia complementaria a una parte de un transcrito de ARN de dicho gen, donde dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle tiene una longitud de aproximadamente 19-45 pares de bases y el bucle de dicha estructura de tronco-bucle comprende aproximadamente 4-25 nucleótidos, donde, después de la introducción de dicha construcción en dicha célula:

(i) se transcribe dicha secuencia de nucleótidos,

(ii) el transcrito resultante de dicha secuencia de nucleótidos se procesa de modo que dicho precursor de miARN se escinde de dicho transcrito de dicha secuencia de nucleótidos,

(iii) dicho precursor de miARN se procesa de modo que un miARN maduro de aproximadamente 21 o 22 nucleótidos de longitud se escinde de dicho precursor de miARN, y

(iv) se realiza la inhibición de la expresión de dicho gen.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho bucle de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN comprende una secuencia correspondiente a un miARN de origen natural.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la base de dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN comprende una región de bases apareadas de al menos 3 pares de bases de longitud.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho promotor es un promotor basado en la polimerasa II.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha célula es una célula cultivada.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha célula es una célula humana o animal no humana aislada.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha célula es una célula vegetal.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 donde dicho miARN maduro induce la degradación de dicho transcrito de ARN de dicho gen.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho transcrito de ARN de dicho gen es un ARNm.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN incluye al menos una protuberancia.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha construcción está presente en un vector viral o un plásmido.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho bucle de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN comprende 6-15 nucleótidos.

13. Una composición que comprende un vehículo y una construcción de ADN que comprende un promotor constitutivo o inducible unido de forma funcional a un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, como parte de una secuencia codificada más larga, un precursor de miARN, comprendiendo dicho precursor de miARN una estructura de tronco-bucle y comprendiendo en dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle una secuencia complementaria a una parte de un transcrito de ARN de un gen diana, donde dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle tiene una longitud de aproximadamente 19-45 pares de bases y el bucle de dicha estructura de tronco-bucle comprende aproximadamente 4-25 nucleótidos, donde dicha construcción es tal que, tras la introducción de dicha construcción en una célula que comprende dicho gen diana, dicho precursor de miARN se transcribe como parte de un transcrito de dicha secuencia codificada más larga que se procesa de modo que dicho precursor de miARN se escinde de la misma, dicho precursor de miARN después se procesa de modo que un miARN maduro de aproximadamente 21 o 22 nucleótidos de longitud se escinde de dicho precursor de miARN, y se realiza la inhibición de la expresión de dicho gen diana.

14. Una célula vegetal o célula humana o animal no humana aislada que comprende una construcción de ADN que comprende un promotor constitutivo o inducible funcional en dicha célula unido de forma funcional a un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, como parte de una secuencia codificada más larga, un precursor de miARN, comprendiendo dicho precursor de miARN una estructura de troncobucle y comprendiendo en dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle una secuencia complementaria a una

parte de un transcrito de ARN de un gen en dicha célula, donde dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle tiene una longitud de aproximadamente 19-45 pares de bases y el bucle de dicha estructura de tronco-bucle comprende aproximadamente 4-25 nucleótidos, donde dicha construcción es tal que, tras la introducción de dicha construcción en dicha célula, dicho precursor de miARN se transcribe como parte de un transcrito de dicha secuencia codificada más larga que se procesa de modo que dicho precursor de miARN se escinde de la misma, dicho precursor de miARN después se procesa de modo que un miARN maduro de aproximadamente 21 o 22 nucleótidos de longitud se escinde de dicho precursor de miARN, y se realiza la inhibición de la expresión de dicho gen.

15. La célula vegetal o la célula humana o animal no humana aisladas de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho bucle de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN comprende una secuencia correspondiente a un miARN de origen natural.

16. La célula vegetal o la célula humana o animal no humana aisladas de acuerdo con la reivindicación 14, donde la base de dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN comprende una región de bases apareadas de al menos 3 pares de bases de longitud.

17. La célula vegetal o la célula humana o animal no humana aisladas de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho promotor es un promotor basado en la polimerasa II. 20

18. La célula vegetal o la célula humana o animal no humana aisladas de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho miARN maduro induce la degradación de dicho transcrito de ARN de dicho gen.

19. La célula vegetal o la célula humana o animal no humana aisladas de acuerdo con la reivindicación 14, donde 25 dicho tronco de dicha estructura de tronco-bucle de dicho precursor de miARN incluye al menos una protuberancia.

20. La célula vegetal o la célula humana o animal no humana aisladas de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicha célula es una célula vegetal presente en una planta.

Fig. 5. Diseño de construcción indicadora. A) secuencias de las dianas sintéticas de ARN usadas en este texto y su apareamiento predicho con los miARN miR-30, anti-miR-30 o miR-21 o el ARNip dNxt. Las secuencias diana eran perfectamente complementarias (P) o se diseñaron para que formaran una protuberancia central de 3 nt (B) . Una secuencia aleatoria, para la cual se sabe que no existe ARN pequeño complementario, se usó como control. B) Estructura de las construcciones indicadoras pCMV-luc-Target y pCMV-luc-Target-CAT. Las dianas, representadas por recuadros negros, son ocho repeticiones en tándem de una de las secuencias mostradas en el panel A. PA, señal de poliadenilación.

Fig. 7. Actividad biológica del miARN humano miR-21. A) Este experimento se realizó como se ha descrito en la Fig. 2B. Los datos muestran el promedio de 4 experimentos independientes. B) Análisis de northern en paralelo de la expresión de ARNm de luc (panel superior) y ∀-gal (panel inferior) . El nivel de actividad enzimática luc detectado con cada construcción indicadora se da como un porcentaje del nivel obtenido tras co-transfección con el plásmido de control pCMV-miR-30. Carril 1, ARN de células 293T transfectadas de forma simulada. La flecha indica la posición del producto de escisión de ARNm de luc de !1, 8 kb.

Fig. 8. Inhibición de utilización de ARNm por un ARNip sintético. A) Los cultivos se co-transfectaron con uno de los tres plásmidos indicadores enumerados junto con el ARNip de dNxt o dTap y los plásmidos de control interno pRL-CMV y pBCI2.CMV∀-gal. La cantidad de cada ARNip usada se da en picomoles. Aproximadamente 40 h después de la transfección, los cultivos se usaron para el ensayo dual de luciferasa o para el aislamiento de ARN. Las actividades luc de luciérnaga se ajustaron para variaciones minoritarias en el control interno de luc de Renilla y se presentan normalizadas a la actividad observada en el cultivo transfectado con el plásmido de control pCMV-lucrandom y el ARNip de control de dTap, que se estableció a 1, 0. Estos datos representan el promedio de tres experimentos independientes, con la desviación típica indicada. B) Análisis de Northern de la expresión del ARNm de luc luciérnaga (panel superior) y ∀-gal (panel inferior) . El nivel de actividad enzimática luc de luciérnaga detectado para cada construcción indicadora se da como un porcentaje del nivel obtenido con el ARNip de control de dTap. Carril 1. ARN de un cultivo transfectado de forma simulada. La flecha indica la posición del producto de escisión del ARNm de luc de !1, 8 kb.