Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado.

Un procedimiento para la producción de L-treonina mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae

, en el que

a) en los microorganismos que ya producen L-treonina se sobre-expresan el ORF yfiD y/o el gen pflB o las secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos, y dichos microorganismos se cultivan en un medio en condiciones en las que la L-treonina está enriquecida en el medio o en las células, y

b) la L-treonina se aísla, con lo que opcionalmente constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2004/003207.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11 45128 ESSEN ALEMANIA.

Inventor/es: FARWICK, MIKE, RIEPING, MECHTHILD.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/54 (Transferasas (2))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P13/08 (Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina)
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Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado.
Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado.

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DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado Campo de la Invención Esta invención se refiere a un procedimiento para la producción fermentativa de L-treonina utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae, en el que se intensifica/intensifican el marco de lectura abierto (ORF) que tiene la designación yfiD y/o el gen pflB.

Antecedentes de la invención L-aminoácidos, en particular L-treonina, encuentran aplicación en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de modo bastante especial, en la nutrición animal.

Es conocido que los L-aminoácidos se producen por fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, el trabajo para mejorar el procedimiento de producción está en constante progreso. Mejoras en el procedimiento pueden estar relacionados con medidas pertenecientes a la tecnología de la fermentación tal como, por ejemplo, la agitación y la provisión de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes tales como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento a la forma de producto, mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, o propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.

Con vista a mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos, se adaptan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De esta manera, se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos tales como, por ejemplo, el análogo de treonina ácido α-amino-β-hidroxivalérico (AHV), o son auxotróficas con respecto a metabolitos de importancia reguladora y que producen L-aminoácidos tales como L- treonina, por ejemplo.

Durante un cierto número de años se han empleado también métodos de tecnología de ADN recombinante para la mejora de cepas de cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, por amplificación de genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales y por la investigación del efecto sobre la producción. Información recopilatoria sobre la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se puede encontrar en Neidhardt (comp.): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2ª Edición, ASM Press, Washington, DC, EE.UU.,(1996).

Objeto de la invención Los autores de la invención se han fijado la misión de producir nuevas medidas disponibles para la producción fermentativa mejorada de L-treonina.

Sumario de la Invención La invención proporciona un procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que ya producen L-treonina y en el que se intensifica/intensifican, en particular se sobre- expresa/sobre-expresan al menos el marco de lectura abierto yfiD y/o el gen pflB, o la o las secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico.

Descripción Detallada de la Invención Cuando se menciona L-treonina en lo que sigue, esto incluye su sal.

El término "intensificación" en este contexto describe el incremento en la actividad intracelular o concentración de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo, aumentando el número de copias del gen o genes, o del ORF o los ORFs en al menos una (1) copia, utilizando un promotor potente o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente con una alta actividad y opcionalmente combinando estas medidas.

La expresión ‘marco de lectura abierto’ (ORF) designa un segmento de una secuencia de nucleótidos que codifica o puede codificar una proteína o, para ser más exactos, un polipéptido o ácido ribonucleico, al cual, de acuerdo con el estado de la técnica, no se le puede asignar función alguna. Después de asignar una función al segmento de la secuencia de nucleótidos en cuestión, se habla generalmente de un gen. El término ‘alelos’ se entiende generalmente para dar a entender formas alternativas de un gen dado. Las formas se distinguen por diferencias en la secuencia de nucleótidos.

La expresión ‘producto génico’ designa, en general, la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir, un ORF, un gen o un alelo, o el ácido ribonucleico codificado.

Mediante las medidas de intensificación, en particular la sobre-expresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa generalmente en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000 ó 2000% en relación con la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial. La expresión ‘microorganismo inicial’ o ‘cepa parental’ se entiende que significa el microorganismo con respecto al cual se llevan a cabo las medidas de acuerdo con la invención.

La invención proporciona un procedimiento para la producción de L-treonina mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, caracterizado por que a) en los microorganismos que ya producen L-treonina se sobre-expresan el ORF yfiD y/o el gen pflB o las secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos, y dichos microorganismos se cultivan en un medio en condiciones en las que la L-treonina está enriquecida en el medio o en las células, y b) la L-treonina se aísla, con lo que opcionalmente constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones (> 0 a 100%) permanecen en el producto aislado o se separan por completo.

Los microorganismos, en particular, microorganismos recombinantes, que también se proporcionan por la presente invención, son capaces de producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón en circunstancias apropiadas, celulosa en circunstancias apropiadas o a partir de glicerol y etanol. Microorganismos de este tipo son representantes de la familia Enterobacteriaceae, seleccionados de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. En el caso del género Escherichia, en particular, se deben mencionar las especies Escherichia coli, y en el caso del género Serratia, en particular la especie Serratia marcescens.

En general, microorganismos recombinantes se generan mediante transformación, transducción o conjugación con un vector que porta el gen deseado.

Cepas adecuadas del género Escherichia, en particular, la especie Escherichia coli que, en particular, producen L- treonina, son, por ejemplo: - Escherichia coli H4581 (documento EP 0 301 572) - Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61 (11): 1877-1882 (1997)) - Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (documento US-A-4278.765) - Escherichia coli VNIIgenetika M1 (documento US-A-4.321.325) - Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (documento US-A-5.631.157) - Escherichia coli BKIIM B-3996 (documento US-A-5.175.107) - Escherichia coli kat 13 (documento WO 98/04715) - Escherichia coli KCCM-10132 (documento WO 00/09660) Cepas productoras de L-treonina adecuadas del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, son, por ejemplo: - Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979)) - Serratia marcescens TLr156 (Gene 57 (2-3): 151-158 (1987)) - Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37 (3): 255-265 (1992)) Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriaceae poseen preferiblemente, entre otras, una o más de las características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende: resistencia al ácido α-amino-β- hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a α-metilserina, resistencia al ácido diaminosuccínico, resistencia al ácido α-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia al ácido ciclopentanocarboxílico, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, necesidad de L-metionina, en circunstancias apropiadas necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso- diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a refinado de treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia al ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina deshidrogenasa defectuosa, en circunstancias apropiadas, capacidad de utilizar sacarosa, intensificación del operón treonina, intensificación de homoserina deshidrogenasa I-aspartato quinasa I, preferiblemente de la forma resistente a la retroalimentación, intensificación de homoserina quinasa, intensificación de treonina sintasa, intensificación de aspartato quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la retroalimentación, intensificación de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, intensificación de fosfoenolpiruvato carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la retroalimentación, intensificación de la fosfoenol piruvato sintasa, intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto génico RhtB, intensificación del producto génico RhtC, intensificación del producto génico YfiK, intensificación de una piruvato carboxilasa y atenuación de la formación de ácido acético.

Se ha encontrado que, después de la sobre-expresión del marco de lectura abierto yfiD y/o del gen pflB o de la o las secuencias que codifican los productos génicos correspondientes, los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae producen L-treonina de una manera mejorada.

Las secuencias de nucleótidos de los genes o marcos de lectura abiertos (ORF) de Escherichia coli pertenecen al estado de la técnica y pueden ser recogidos de la secuencia del genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277:1453-1462 (1997)).

El marco de lectura abierto yfiD y la proteína codificada por este ORF se describen, entre otros, por los siguientes datos: Denominación: marco de lectura abierto Función: formiato acetiltransferasa putativo Descripción: el marco de lectura abierto yfiD codifica una proteína de 14,3 kDa, el punto isoeléctrico se sitúa en 5,1; localizado cromosómicamente, está situado, por ejemplo en el caso de Escherichia coli K12 MG1655, en la región intergénica del marco de lectura abierto yfiK que codifica una L-aspartato oxidasa putativa, y el gen ung que codifica uracil ADN glicosilasa Referencia: Blankenhorn et al;. Journal of Bacteriology 181 (7): 2209-2216 (1999) Fountoulakis et al.; Electrophoresis 20(11): 2181-2195 (1999) Kirkpatrick et al.; Journal of Bacteriology 183 (21): 6466-6477 (2001) Wyborn et al.; Microbiology148:1015-1026 (2002) Nº de Acceso: AE000344 El gen pflB y la proteína codificada por este gen se describen, entre otros, por los siguientes datos: Denominación: formiato acetiltransferasa I, piruvato formiato liasa I EC Nº:.

2.3.1.54 Referencia: Rodel et al.; European Journal of Biochemistry 177(1): 153-158 (1988), Wagner et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89 (3): 996-1000 (1992) Nº de Acceso: AE000192 Nombre alternativo del gen: pf1 La piruvato formiato liasa de Salmonella typhimurium se describe, entre otros, en la siguiente referencia: Wong et al.; Journal of Bacteriology 171(9): 4900-4905 (1989).

Las secuencias de ácidos nucleicos pueden recogerse de las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.), de la base de datos de Secuencias de Nucleótidos de European Molecular Biology Laboratory (EMBL, Heidelberg, Alemania y Cambridge, Reino Unido) o de DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japón).

Por motivos de una mejor claridad, la secuencia conocida referida al ORF yfiD se representa bajo SEQ ID NO. 3. La proteína codificada por este marco de lectura se representa como SEQ ID NO. 4.

Los marcos de lectura abiertos descritos en los pasajes especificados se pueden utilizar de acuerdo con la invención. Además de ello, se pueden utilizar alelos de los genes o marcos de lectura abiertos, que resultan de la degeneración del código genético o en virtud de mutaciones de sentido funcionalmente neutras. Se prefiere el uso de genes endógenos o de marcos de lectura abiertos endógenos.

La expresión ‘genes endógenos’ o ‘secuencias de nucleótidos endógenas’ se entiende que significa los genes o marcos de lectura abiertos o alelos o, para ser más exactos, secuencias de nucleótidos que están presentes en la población de una especie.

Alelos adecuados incluyen los que se pueden obtener mediante hibridación, en particular bajo condiciones rigurosas utilizando SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 7 o partes de las mismas, en particular, las regiones codificadoras o las secuencias complementarias a las mismas.

Instrucciones sobre la identificación de las secuencias de ADN por medio de hibridación se pueden encontrar por una persona experta en la técnica, entre otros, en el manual titulado “The DIG System Users Guide for Filter Hybridation”, producido por Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar bajo condiciones rigurosas - es decir, sólo se forman híbridos en los que la sonda y la secuencia diana, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos un 70% idénticos. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, incluidas las etapas de lavado, se ve influenciada o determinada al variar la composición del tampón, la temperatura y la concentración salina. La reacción de hibridación se lleva a cabo generalmente con una rigurosidad relativamente baja en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación se puede emplear, por ejemplo, un tampón correspondiente a tampón 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50 ºC - 68 ºC. A este respecto, también se pueden hibridar sondas con polinucleótidos que exhiben menos de un 70% de identidad con la secuencia de la sonda. Híbridos de este tipo son menos estables y se separan mediante lavado bajo condiciones rigurosas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, reduciendo la concentración salina a 2x SSC y, opcionalmente, subsiguientemente a 0,5x SSC (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose a una temperatura de aproximadamente 50 ºC - 68 ºC, aproximadamente 52 ºC - 68 ºC, aproximadamente 54 ºC - 68 ºC, aproximadamente 56 ºC - 68 ºC, aproximadamente 58 ºC - 68 ºC, aproximadamente 60 ºC - 68 ºC, aproximadamente 62 ºC - 68 ºC, aproximadamente 64 ºC - 68 ºC o aproximadamente 66 ºC - 68 ºC. Opcionalmente, es posible reducir la concentración salina a una concentración correspondiente a 0,2x SSC o a 0,1x SSC. Mediante el incremento escalonado de la temperatura de hibridación en pasos de aproximadamente 1 - 2 ºC desde 50 ºC a 68 ºC, se pueden aislar fragmentos de polinucleótidos que, por ejemplo, poseen al menos un 70% o al menos un 80% o al menos un 90% a 95% o al menos un 96% a 99% de identidad con la secuencia de la sonda empleada. Instrucciones adicionales sobre la hibridación se pueden obtener en el comercio en forma de los denominados kits (p. ej. DIG Easy Hyb producido por Roche Diganostics GmbH, Mannheim, Alemania, Nº de catálogo 1603558).

Con vistas a conseguir una intensificación, se puede aumentar la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos o alelos, o se pueden intensificar las propiedades catalíticas o reguladoras (actividad) de las proteínas, por ejemplo. Ambas medidas pueden opcionalmente combinarse.

Con vistas a conseguir una sobre-expresión, se puede aumentar, por ejemplo, el número de copias de los genes o marcos de lectura abiertos correspondientes, o se puede mutar la región del promotor y de regulación o el sitio de unión al ribosoma, que está situado aguas arriba del gen estructural. Casetes de expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan de una manera similar. Por medio de promotores inducibles, es adicionalmente posible elevar la expresión en el transcurso de la producción fermentativa de L-treonina. En virtud de medidas para prolongar la vida útil del ARNm, se mejora igualmente la expresión. Además de ello, al prevenir la degradación de la proteína enzimática, la actividad enzimática se potencia igualmente. Los genes o construcciones de genes pueden estar presentes en plásmidos que se replican de forma extra-cromosómica con un número diferente de copias o pueden estar integrados dentro del cromosoma y amplificados. Alternativamente, se puede obtener, adicionalmente, una sobre-expresión de los genes en cuestión cambiando la composición de los medios y mediante la gestión del cultivo.

Instrucciones sobre ello pueden encontrarse por parte de la persona experta en la técnica, entre otros, en Chang y Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y Brosius (Gene 40: 183-190 (1985), en de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193)), en el documento WO98/04715, en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos sobre genética y biología molecular.

Se puede hacer uso de vectores de plásmidos capaces de replicarse en Enterobacteriaceae tales como, por ejemplo, vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1998)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983). Una cepa transformada con un vector de plásmido se puede emplear en un procedimiento de acuerdo con la invención, en cuyo caso el vector del plásmido porta al menos el ORF yfiD y/o el gen pflB o secuencias de nucleótidos o alelos que codifican los productos génicos de los mismos.

Por el término “transformación” se entiende la absorción de un ácido nucleico aislado por parte de un huésped (microorganismo).

Igualmente, es posible transferir mutaciones que se refieren a la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos respectivos en diversas cepas mediante intercambio de la secuencia (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)).

Explicaciones detalladas relacionadas con los términos de genética y biología molecular se pueden encontrar en libros de texto conocidos sobre genética y biología molecular tales como, por ejemplo, el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4ª ed., Springer Verlag, Nueva York (EE.UU.), 2000 o el libro de texto de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5ª ed., Freeman and Company, Nueva York (EE.UU.) 2002), o el libro de texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (obra de 3 tomos), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).

Además de ello, para la producción de L-treonina con cepas de la familia Enterobacteriaceae puede ser ventajoso, además de la intensificación del ORF yfiD y/o del gen pflB, intensificar una o más enzimas de la vía de biosíntesis de treonina conocida o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido o enzimas de la glicolisis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del azufre. Generalmente, se prefiere el uso de genes endógenos.

Por lo tanto, por ejemplo, simultáneamente se intensifican, en particular sobre-expresan uno o más de los genes seleccionados del grupo que comprende ● el operón thrABC que codifica aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa (documento US-A-4.278.765), ● el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilasa (documento WO 99/18228), ● el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992)), ● el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (Gene 31:279-283 (1984)), ● los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)), ● el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina (documento EP-A-0 994 190), ● el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa (documento WO 02/06459), ● el gen rhtC que imparte resistencia a treonina (documento EP-A-1 013 765), ● el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación de treonina (documento WO 01/92545), ● el gen gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11:5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)), ● el gen hns que codifica la proteína de unión a ADN HLP-II (documento WO 03/004671), ● el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (WO 03/004598), ● el gen fba que codifica fructosa bifosfato aldolasa (documento WO 03/004664), ● el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674), ● el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674), ● el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente específico para glucosa IIA del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674), ● el gen ptsG que codifica el componente específico para glucosa IIBC (documento WO 03/004670), ● el gen lrp que codifica el regulador del regulón de leucina (documento WO 03/004665), ● el gen csrA que codifica el regulador global Csr (Journal of Bacteriology175:4744-4755 (1993)), ● el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad (Nucleic Acids Research 16:7995- 8009 (1988)), ● el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo intermediario central (Journal of Bacteriology 172:2642-2649 (1990)), ● el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kDa (documento WO 03/004669), que también se conoce bajo la denominación ‘groES’, ● el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa (documento WO 03/004663), ● el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa (documento WO 03/004663), ● el gen cysK que codifica cisteína sintasa A (documento WO 03/006666), ● el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys (documento WO 03/006666), ● el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de NADPH sulfito reductasa (documento WO 03/006666), ● el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de NADPH sulfito reductasa (documento WO 03/006666), ● el gen cysH del operón cysJIH que codifica la adenilil sulfato reductasa (documento WO 03/006666), ● el gen phoB del operón phoBR que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho (documento WO 03/008606), ● el gen phoR del operón phoBR que codifica la proteína sensor del regulón pho (documento WO 03/008606), ● el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana celular externa (documento WO 03/008608), ● el gen pykF que codifica piruvato quinasa I que es estimulada por fructosa (documento WO 03/008609), ● el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II (documento WO 03/008610), ● el gen malE que codifica la proteína de unión periplásmica de transporte de maltosa (documento WO 03/008605), ● el gen sodA que codifica superóxido dismutasa (documento WO 03/008613), ● el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (documento WO 03/008612), ● el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global de los factores sigmaE (documento WO 03/008612), ● el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa (documento WO 03/008614), ● el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad E2 de dihidrolipoil trans-succinasa de 2- cetoglutarato deshidrogenasa (documento WO 03/008614), ● el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad β de succinil-CoA sintetasa (documento WO 03/008615), ● el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad α de succinil-CoA sintetasa (documento WO 03/008615), ● el gen adk que codifica la adenilato quinasa (Nucleic Acids Research 13(19):7139-7151 (1985)), ● el gen hdeA que codifica una proteína periplásmica con función de tipo chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23):7747-7748 (1993)), ● el gen hdeB que codifica una proteína periplásmica con función de tipo chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23):7747-7748 (1993)), ● el gen icd que codifica la isocitrato deshidrogenasa (Journal of Biological Chemistry 262(22): 10422-10425 (1987)), ● el gen mglB que codifica la proteína de transporte de unión a galactosa, periplásmica (Molecular and General Genetics 229(3):453-459 (1991)), ● el gen lpd que codifica dihidrolipoamida deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 135(3):519-527 (1983)), ● el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 133(1):155-162 (1983)), ● el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 133(3):481-489 (1983)), ● el gen pepB que codifica la aminopeptidasa B (Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392-397 (1996)), ● el gen aldH que codifica la aldehído deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.3) (Gene 99(1): 15-23 (1991)), ● el gen bfr que codifica la homoproteína de almacenamiento de hierro (bacterioferritina) (Journal of Bacteriology 171(7): 3940-3947 (1989)), ● el gen udp que codifica uridina fosforilasa (Nucleic Acids Research 17(16):6741 (1989)) y ● el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355- 371 (1997)).

Además de ello, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina, además de la intensificación del ORF yfiD y/o del gen pflB, atenuar, en particular eliminar o disminuir la expresión de uno o más de los genes seleccionados del grupo que comprende ● el gen tdh que codifica treonina deshidrogenasa (Journal of Bacteriology169: 4716-4721 (1987)), ● el gen mdh que codifica malato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)), ● el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA (Número de Acceso AAC77180 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) (documento WO 02/29080), ● el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP (Número de Acceso AAC77179 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), (documento WO 02/29080), ● el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (documento WO 02/29080), ● el gen poxB que codifica piruvato oxidasa (documento WO 02/36797), ● el gen aceA que codifica la enzima isocitrato liasa (documento WO 02/081722), ● el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (documento WO 02/081721), que también se conoce bajo la denominación ‘gen mlc’, ● el gen fruR que codifica el represor de fructosa (documento WO 02/081698), que también se conoce bajo la denominación ‘gen cra’, ● el gen rpoS que codifica el factor sigma38 (documento WO 01/05939), que también se conoce bajo la denominación ‘gen katF’, ● el gen aspA que codifica la aspartato amonio liasa (documento WO 03/008603) y ● el gen aceB que codifica malato sintasa A (documento WO 03/008604).

El término "atenuación" en este contexto describe la disminución o eliminación de la actividad intracelular o concentración de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que es/son codificadas por el ADN correspondiente, utilizando, por ejemplo, un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente o el marco de lectura abierto o el gen y combinando opcionalmente estas medidas.

Mediante las medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce generalmente de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ó 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o, para ser más exactos, de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial.

Además de ello, para la producción de L-treonina puede ser ventajoso, además de la intensificación de los ORFs yfiD y/o del gen pflB, eliminar reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”, en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (comps.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención se pueden cultivar en el proceso por tandas, en el proceso por tandas alimentado o en el proceso por tandas alimentado repetido. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer las demandas de las cepas respectivas de una manera adecuada. Descripciones de medios de cultivo de diversos microorganismos están contenidos en el manual titulado "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981).

A modo de fuente de carbono, se puede hacer uso de azúcares e hidratos de carbono tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y, en circunstancias apropiadas, celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de copra, ésteres de ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o en forma de una mezcla.

A modo de fuente de nitrógeno, se puede hacer uso de compuestos nitrogenados orgánicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz macerado, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de una mezcla.

A modo de fuente de fósforo, se puede hacer uso de ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio, hidrógeno- fosfato dipotásico o las sales correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener, además, sales de metales, tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Por último, además de las sustancias antes mencionadas, se pueden emplear sustancias reguladoras del crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas. Precursores adecuados se pueden añadir, además de ello, al medio de cultivo. Los materiales de alimentación establecidos se pueden añadir al cultivo en forma de una sola tanda o se pueden añadir durante el cultivo de manera adecuada.

La fermentación se lleva a cabo generalmente a un valor del pH de 5,5 a 9,0, en particular 6,0 a 8,0. Para los fines de controlar el pH del cultivo se emplean de manera adecuada compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o líquido amoníacal acuoso o compuestos de carácter ácido tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Con el fin de controlar el desarrollo de espuma se pueden emplear agentes antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Con el fin de mantener la estabilidad de los plásmidos pueden añadirse al medio, sustancias adecuadas de acción selectiva, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como aire, por ejemplo. La temperatura del cultivo cultura es normalmente alrededor de 25 °C a 45 °C y preferiblemente en torno a 30 °C hasta 40 °C. El cultivo se continúa hasta que se haya formado un máximo de L-aminoácidos o, para ser más exactos, de L-treonina. Este objetivo se logra normalmente en el espacio de 10 horas a 160 horas.

El análisis de los L-aminoácidos se puede llevar a cabo mediante cromatografía de intercambio de aniones con subsiguiente derivatización con ninhidrina tal como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190- 1206 (1958)), o puede tener lugar mediante HPLC de fase inversa tal como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

El procedimiento de acuerdo con la invención sirve preferiblemente para la producción fermentativa de L-treonina.

La presente invención se elucidará con mayor detalle en lo que sigue sobre la base de realizaciones a modo de ejemplo.

Medios mínimos (M9) y medios completos (LB) que se utilizan para Escherichia coli se describen por J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de ADN del plásmido de Escherichia coli y también todas las técnicas relacionadas con la restricción, ligamiento, tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. La transformación de Escherichia coli se lleva a cabo, a menos que se describa de otro modo, de acuerdo con Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).

La temperatura de incubación en el transcurso de la producción de cepas y transformantes es 37 ºC.

Ejemplo 1 1. 1 Construcción del plásmido de expresión pTrc99AyfiD El marco de lectura abierto yfiD de E. coli K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y también oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto yfiD en E. coli K12, MG1655 (número de acceso AE000344, Blattner et al. (Science 277: 1453-1474 (1997)), se sintetizan cebadores de la PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Los cebadores contienen secuencias para las enzimas de restricción que están marcadas mediante subrayado en la secuencia de nucleótidos representada más adelante. El cebador yfiD1 contiene el sitio de restricción para XbaI; el cebador yfiD2 contiene el sitio de restricción para HindIII.

El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655 empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando “Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 431 pb se puede amplificar con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) con Vent-ADN- polimerasa (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID Nº 3).

El producto de la PCR se restringe con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se examina en un gel de agarosa al 0,8% después de haberse purificado (kit de purificación, QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las enzimas HindIII y XbaI, y se liga con el fragmento yfiD restringido. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF’ (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con la tanda de ligamiento, y células portadoras de plásmidos se seleccionan en agar LB al que se han añadido 50 μg/ml de ampicilina. La clonación con éxito se puede demostrar después del aislamiento del ADN del plásmido mediante escisión control con las enzimas HindIII/XbaI y HpaI. El plásmido se designa pTrc99AyfiD (Figura 1).

1.2 Construcción del plásmido de expresión pTrc99ApflB El gen pflB de E. coli K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y también oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen pflB en E. coli K12, MG1655 (número de acceso AE000192, Blattner et al. (Science 277: 1453-1474 (1997)), se sintetizan cebadores de la PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Los cebadores contienen secuencias para las enzimas de restricción que están marcadas mediante subrayado en la secuencia de nucleótidos representada más adelante. El cebador pflB1 contiene el sitio de restricción para XbaI; el cebador pflB2 contiene el sitio de restricción para HindIII.

El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655 empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando “Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 2325 pb se puede amplificar con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) con Vent-ADN- polimerasa (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID Nº 7).

El producto de la PCR se restringe con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se examina en un gel de agarosa al 0,8% después de haberse purificado (kit de purificación, QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las enzimas HindIII y XbaI, y se liga con el fragmento pflB restringido. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF’ (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con la tanda de ligamiento, y células portadoras de plásmidos se seleccionan en agar LB al que se han añadido 50 μg/ml de ampicilina. La clonación con éxito se puede demostrar después del aislamiento del ADN del plásmido mediante escisión control con las enzimas HindIII/XbaI y PauI. El plásmido se designa pTrc99ApflB (Figura 2).

Ejemplo 2 2.1 Producción de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99AyfiD La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina se describe en la memoria descriptiva de la patente US-A- 4.278.765 y se deposita en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628.

La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99AyfiD descrito en el Ejemplo 1.1 y con el vector pTrc99A, y células portadoras de plásmidos se seleccionan en agar LB con 50 μg/ml de ampicilina. De este modo, surgen las cepas MG442/pTrc99AyfiD y MG442/pTrc99A. Colonias sencillas seleccionadas se multiplican subsiguientemente de manera adicional en medio mínimo que tiene la siguiente composición: 3,5 g/l de Na2HPO4*2H2O, 1,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de MgSO4*7H2O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de L-treonina se examina en cultivos en tandas de 10 ml, que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para este fin, 10 ml de medio de pre-cultivo que tiene la siguiente composición: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4*7H2O, 15 g/l de CaCO3, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina, se inoculan e incuban durante 16 horas a 37 ºC y a 180 rpm en una incubadora ESR fabricada por Kühner AG (Birsfelden, Suiza). 250 μl de una vez de este pre-cultivo se inoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 0,03 g/l de FeSO4*7H2O, 0,018 g/l de MnSO4*1H2O, 30 g/l de CaCO3, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37 ºC. La formación de L-treonina mediante la cepa MG442 inicial se examina de la misma manera, no existiendo, sin embargo, adición alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (OD) de la suspensión de cultivo a una longitud de onda de medición de 660 nm con un fotómetro LP2W fabricado por Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania).

Subsiguientemente se determina la concentración de L-treonina que se ha formado en el sobrenadante del cultivo filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos fabricado por Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania), mediante cromatografía de intercambio de iones y reacción post-columna con detección de ninhidrina.

El resultado del experimento se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1 Cepa DO L-treonina g/l (660 nm) MG442 5,6 1,4 MG442/pTrc99A 3,8 1,3 MG442/pTrc99AyfiD 5,5 2,5 2.1 Producción de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99ApflB La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina se describe en la memoria descriptiva de la patente US-A- 4.278.765 y se deposita en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628.

La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99ApflB descrito en el Ejemplo 1.2 y con el vector pTrc99A, y células portadoras de plásmidos se seleccionan en agar LB con 50 μg/ml de ampicilina. De este modo, surgen las cepas MG442/pTrc99ApflB y MG442/pTrc99A. Colonias sencillas seleccionadas se multiplican subsiguientemente de manera adicional en medio mínimo que tiene la siguiente composición: 3,5 g/l de Na2HPO4*2H2O, 1,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de MgSO4*7H2O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de L-treonina se examina en cultivos en tandas de 10 ml, que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para este fin, 10 ml de medio de pre-cultivo que tiene la siguiente composición: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4*7H2O, 15 g/l de CaCO3, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina, se inoculan e incuban durante 16 horas a 37 ºC y a 180 rpm en una incubadora ESR fabricada por Kühner AG (Birsfelden, Suiza). 250 μl de una vez de este pre-cultivo se inoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 0,03 g/l de FeSO4*7H2O, 0,018 g/l de MnSO4*1H2O, 30 g/l de CaCO3, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37 ºC. Con vistas a completar la inducción de la expresión del gen pflB, se añaden 100 mg/l de isopropil-β-D- tiogalactopiranósido (IPTG) en tandas paralelas. La formación de L-treonina por parte de la cepa MG442 inicial se examina de la misma manera, no existiendo, sin embargo, adición alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (OD) de la suspensión de cultivo a una longitud de onda de medición de 660 nm con un fotómetro LP2W fabricado por Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania).

Subsiguientemente se determina la concentración de L-treonina que se ha formado en el sobrenadante del cultivo filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos fabricado por Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania), mediante cromatografía de intercambio de iones y reacción post-columna con detección de ninhidrina.

El resultado del experimento se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2 Cepa Aditivos DO L-treonina g/l (660 nm) MG442 - 5,6 1,4 MG442/pTrc99A - 3,8 1,3 MG442/pTrc99ApflB - 5,6 1,9 MG442/pTrc99ApflB IPTG 5,2 2,2 Breve descripción de las Figuras: Los datos de longitud han de interpretarse como datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones que se utilizan tienen el siguiente significado: ● Amp: gen de resistencia a ampicilina ● lacI: gen para la proteína represora del promotor trc ● Ptrc; región del promotor trc, inducible por IPTG ● yfiD: región codificadora del marco de lectura abierto yfiD ● pflB: región codificadora del gen pflB ● 5S: región de ARNr de 5S ● rrnBT: región del terminador de ARNr Las abreviaturas para las enzimas de restricción tienen el siguiente significado: ● HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenze Rc ● HpaI: endonucleasa de restricción de Haemophilus parainfluenzae ● PauI: endonucleasa de restricción de Paracoccus alcaliphilus ● XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris LISTADO DE SECUENCIAS <110> Degussa AG <120> Procedimiento para la producción de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae <130> 020489 BT <140> 8 <170> PatentIn versión 3.1 <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <221> Cebador <222> (1)…(30) <223> yfiD1 <220> <221> Sitio de restricción <222> (9)…(14) <223> Sitio XbaI <400> 1 <210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <221> Cebador <222> (1)…(24) <223> yfiD2 <220> <221> Sitio de restricción <222> (8)…(13) <223> Sitio HindIII <400> 2 <210> 3 <211> 431 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> Producto de PCR yfiD <222> (1)…(431) <223> <220> <221> CDS <222> (36)…(419) <223> marco de lectura abierto yfiD <400> 3 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <221> Cebador <222> (1)…(28) <223> pflB1 <220> <221> Sitio de restricción <222> (5)…(10) <223> Sitio XbaI <400> 5 <210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <221> Cebador <222> (1)…(27) <223> pflB2 <220> <221> Sitio de restricción <222> (13)…(18) <223> Sitio HindIII <400> 6 <210> 7 <211> 2325 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> Producto de PCR pflB <222> (1)…(2325) <223> <220> <221> CDS <222> (24)…(2306) <223> Región codificadora de pflB <400> 7

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la producción de L-treonina mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, en el que a) en los microorganismos que ya producen L-treonina se sobre-expresan el ORF yfiD y/o el gen pflB o las secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos, y dichos microorganismos se cultivan en un medio en condiciones en las que la L-treonina está enriquecida en el medio o en las células, y b) la L-treonina se aísla, con lo que opcionalmente constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se emplean microorganismos recombinantes que son generados por la transformación de un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae con un vector, conteniendo dicho vector el ORF yfiD y/o el gen pflB.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el o los números de copias del gen/genes y/u ORF en los microorganismos recombinantes se incrementa/incrementan en al menos 1.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el incremento en el número de copias del ORF yfiD y/o el gen pflB en al menos 1 se consigue mediante integración del gen en el cromosoma del microorganismo.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el incremento en el número de copias del ORF yfiD y/o el gen pflB en al menos 1 se consigue mediante un vector de replicación extracromosómico.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que con vistas a lograr la sobre-expresión a) se muta la región del promotor y de regulación o el sitio de unión al ribosoma aguas arriba del ORF yfiD y/o el gen pflB, o b) se incorporan casetes de expresión o promotores aguas arriba del ORF yfiD y/o del gen pflB.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se hace uso de un ORF yfiD y/o de un gen pflB que está bajo el control del promotor.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se emplean los microorganismos se seleccionan del género Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia.

9. Procedimiento para la producción de L-treonina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se fermentan los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, en el que, además, simultáneamente se intensifican, en particular sobre-expresan uno o más de los genes seleccionados del grupo que comprende: 9.1 el operón thrABC que codifica aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa, 9.2 el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa, 9.3 el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato sintasa, 9.4 el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa, 9.5 los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa, 9.6 el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina, 9.7 el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa, 9.8 el gen rhtC que imparte resistencia a treonina, 9.9 el gen thrE que codifica la proteína de exportación de treonina, 9.10 el gen gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa, 9.11 el gen hns que codifica la proteína de unión a ADN HLP-II, 9.12 el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa, 9.13 el gen fba que codifica fructosa bifosfato aldolasa, 9.14 el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa, 9.15 el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa, 9.16 el gen crr que codifica el componente específico para glucosa IIA, 9.17 el gen ptsG que codifica el componente específico para glucosa IIBC, 9.18 el gen lrp que codifica el regulador del regulón de leucina, 9.19 el gen csrA que codifica el regulador global Csr, 9.20 el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad, 9.21 el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo intermediario central, 9.22 el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kDa, 9.23 el gen ahpC que codifica la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa, 9.24 el gen ahpF que codifica la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa, 9.25 el gen cysK que codifica cisteína sintasa A, 9.26 el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys, 9.27 el gen cysJ que codifica la flavoproteína de NADPH sulfito reductasa, 9.28 el gen cysI que codifica la hemoproteína de NADPH sulfito reductasa, 9.29 el gen cysH que codifica la adenilil sulfato reductasa, 9.30 el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho, 9.31 el gen phoR que codifica la proteína sensor del regulón pho, 9.32 el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana celular externa, 9.33 el gen pykF que codifica piruvato quinasa I que es estimulada por fructosa, 9.34 el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II, 9.35 el gen malE que codifica la proteína de unión periplásmica de transporte de maltosa, 9.36 el gen sodA que codifica superóxido dismutasa, 9.37 el gen rseA que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE, 9.38 el gen rseC que codifica un regulador global del factor sigmaE, 9.39 el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa, 9.40 el gen sucB que codifica la subunidad E2 de dihidrolipoil trans-succinasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa, 9.41 el gen sucC que codifica la subunidad β de succinil-CoA sintetasa, 9.42 el gen sucD que codifica la subunidad α de succinil-CoA sintetasa, 9.43 el gen adk que codifica la adenilato quinasa, 9.44 el gen hdeA que codifica una proteína periplásmica con función de tipo chaperonina, 9.45 el gen hdeB que codifica una proteína periplásmica con función de tipo chaperonina, 9.46 el gen icd que codifica la isocitrato deshidrogenasa, 9.47 el gen mglB que codifica la proteína de transporte de unión a galactosa, periplásmica, 9.48 el gen lpd que codifica dihidrolipoamida deshidrogenasa, 9.49 el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-deshidrogenasa, 9.50 el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa, 9.51 el gen pepB que codifica la aminopeptidasa B, 9.52 el gen aldH que codifica la aldehído deshidrogenasa, 9.53 el gen bfr que codifica la homoproteína de almacenamiento de hierro, 9.54 el gen udp que codifica uridina fosforilasa y 9.55 el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE.

10. Procedimiento para la producción de L-treonina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se fermentan los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, en el que, además, simultáneamente se atenua/atenúan, en particular eliminan, o se disminuye la expresión de los mismos, de uno o más de los genes seleccionados del grupo que comprende: 10.1 el gen tdh que codifica treonina deshidrogenasa, 10.2 el gen mdh que codifica malato deshidrogenasa, 10.3 el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA, 10.4 el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP, 10.5 el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, 10.6 el gen poxB que codifica piruvato oxidasa, 10.7 el gen aceA que codifica isocitrato liasa, 10.8 el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa, 10.9 el gen fruR que codifica el represor de fructosa, 10.10 el gen rpoS que codifica el factor sigma38, 10.11 el gen aspA que codifica la aspartato amonio liasa, 10.12 el gen aceB que codifica malato sintasa A.