Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo.

n polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y

b) un fragmento a) que tiene actividad celulolítica

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10191152.

Solicitante: ROAL OY.

Nacionalidad solicitante: Finlandia.

Dirección: TYKKIMÄENTIE 15 05200 RAJAMÄKI FINLANDIA.

Inventor/es: VEHMAANPERA, JARI, SIIKA-AHO, MATTI, VIIKARI, LIISA, KALLIO,JARNO, PURANEN,TERHI, ALAPURANEN,Marika, JÄMSÄ,SATU, VOUTILAINEN,SANNI, HALONEN,TEEMU.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/56 (que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/06 (Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/42 (actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/14 (Microorganismos fúngicos (cultivo de setas A01G 1/04; como novedades vegetales A01H 15/00 ); Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/02 (Monosacáridos)

PDF original: ES-2527681_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de productos hidrolizados de azúcares a partir de material celulósico. Más precisamente, la invención se refiere a la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico mediante conversión enzimática. Los azúcares fermentables son, p. ej., útiles en la producción de bioetanol, o para otros fines. En particular, la invención se refiere a un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, y opcionalmente xilanasa, y a preparaciones enzimáticas y a los usos de las mismas. La invención se refiere adicionalmente a nuevos polipéptidos celulolíticos, los polinucleótidos que los codifican, y a vectores y células anfitrionas que contienen los polinucleótidos. También adicionalmente, la invención se refiere a los usos de los polipéptidos y a un método para su preparación.

Antecedentes de la invención Los productos hidrolizados de azúcares se pueden utilizar para la producción microbiana de una variedad de sustancias químicas puras o biopolímeros, tales como ácidos orgánicos, por ejemplo ácido láctico, o etanol u otros alcoholes, por ejemplo n-butanol, 1, 3-propanodiol, o polihidroxialcanoatos (PHA) . Los productos hidrolizados de azúcares también pueden servir como materia prima para otros procesos no microbianos, por ejemplo, para el enriquecimiento, el aislamiento y la purificación de azúcares de alto valor o para diversos procedimientos de polimerización. Uno de los principales usos de los productos hidrolizados de azúcares es en la producción de biocombustibles. La producción de bioetanol y/u otros productos químicos puede tener lugar en un procedimiento integrado en una biorrefinería (Wyman 2001) .

Los recursos limitados de combustibles fósiles, y las cantidades crecientes de CO2 liberado de los mismos y que causan el fenómeno de efecto invernadero han planteado la necesidad de utilización de la biomasa como fuente de energía renovable y limpia. Una tecnología prometedora alternativa es la producción de biocombustibles, es decir, etanol a partir de materiales celulósicos. En el sector del transporte los biocombustibles son, por el momento la única opción, lo que podría reducir las emisiones de CO2 en un orden de magnitud. El etanol puede utilizarse en vehículos y sistemas de distribución existentes y por lo tanto no requiere de inversiones en infraestructuras costosas. Los azúcares derivados de materias primas lignocelulósicas renovables se pueden utilizar también como materias primas para una variedad de productos químicos que pueden sustituir los productos químicos con una base oleosa.

La mayor parte de los carbohidratos en las plantas están en forma de lignocelulosa, que consiste esencialmente en celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina. En un procedimiento de lignocelulosa a etanol el material lignocelulósico se pretrata en primer lugar químicamente o físicamente para hacer la fracción de celulosa más accesible a la hidrólisis. La fracción de celulosa es hidrolizada a continuación para obtener azúcares que pueden ser fermentados por levaduras a etanol. La lignina se obtiene en forma de un co-producto principal que se puede utilizar como combustible sólido.

Los costes de producción de bioetanol son altos y la producción de energía es baja, y hay una continua búsqueda de hacer el proceso más económico. La hidrólisis enzimática se considera la tecnología más prometedora para la conversión de biomasa celulósica en azúcares fermentables. Sin embargo, la hidrólisis enzimática se utiliza solo hasta una cantidad limitada a escala industrial, y especialmente cuando se utiliza material fuertemente lignificado como la madera o residuos agrícolas, la tecnología no es satisfactoria. El coste de la etapa enzimática es uno de los principales factores económicos del procedimiento. Se han realizado esfuerzos para mejorar la eficiencia de la hidrólisis enzimática del material celulósico (Badger 2002) .

El documento US 2002/019 2774 A1 describe un procedimiento continuo para la conversión de biomasa lignocelulósica sólida en productos carburantes combustibles. Después del pretratamiento por oxidación húmeda o explosión de vapor de agua se separa la biomasa parcialmente en celulosa, hemicelulosa y lignina, y a continuación se somete a hidrólisis parcial utilizando una o más enzimas carbohidrasas (EC 3.2) . Se proporciona como ejemplo Celluclast™, un producto comercial de Novo Nordisk A/S que contiene actividades celulasa y xilanasa.

El documento US 2004/000 5674 A1 describe nuevas mezclas de enzimas que se pueden utilizar directamente en el sustrato lignocelulósico, por medio de lo cual se pueden evitar los productos de desecho tóxicos formados durante los procedimientos de pretratamiento, y se puede ahorrar energía. La mezcla de enzimas sinérgica contiene una celulasa y una enzima auxiliar tal como celulasa, xilanasa, ligninasa, amilasa, proteasa, lipidasa o glucuronidasa, o cualquier combinación de las mismas. Se considera que la celulasa incluye endoglucanasa (EG) , beta-glucosidasa (BG) y celobiohidrolasa (CBH) . Los ejemplos ilustran el uso de una mezcla de preparaciones de xilanasa y celulasa de Trichoderma.

Kurabi et al. (2005) han investigado la hidrólisis enzimática de abeto de Douglas pretratado mediante explosión de vapor y organosolv con etanol mediante celulasas fúngicas novedosas y comerciales. Sometieron a ensayo dos 2 5

preparaciones de celulasa de Trichoderna reesei comerciales, y dos nuevas preparaciones producidas por cepas mutantes de Trichoderma sp. y Penicillium sp. La preparación de Trichoderma sp. mostró un funcionamiento significativamente mejor que las otras preparaciones. Se creía que el mejor funcionamiento era debido al menos en parte a una actividad beta-glucosidasa significativamente mayor, lo que alivia la inhibición por producto de celobiohidrolasa y endoglucanasa.

El documento US 2004/005 3373 A1 se refiere un método para convertir celulosa en glucosa mediante el tratamiento de un substrato lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende celulasa y una celobiohidrolasa I modificada (CBHI) . La CBHI se ha modificado mediante la inactivación de su dominio de unión a celulosa (CBD) . Las ventajas de la modificación de CBHI son, por ejemplo una mejor recuperación y una mayor tasa de hidrólisis con alta concentración de sustrato. La celulasa se selecciona del grupo que consiste en EG, CBH y BG. La CBHI se obtiene preferiblemente a partir deTrichoderma.

El documento US 2005/016 4355 A1 describe un método para degradar material lignocelulósico con una o más enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo. También se pueden utilizar enzimas adicionales, tales como hemicelulasas, esterasa, peroxidasa, proteasa, lacasa o mezclas de las mismas. La presencia del agente tensioactivo aumenta la degradación de material lignocelulósico en comparación con la ausencia de tensioactivo. Las enzimas celulolíticas pueden ser cualquier enzima implicada en la degradación de la lignocelulosa incluyendo CBH, EG y BG.

Existe un gran número de publicaciones que describen diversas celulasas y hemicelulasas.

Las celobiohidrolasas (CBHS) se describen por ejemplo en el documento WO 03/000 941, que se refiere a las enzimas CBHI obtenidas a partir de diversos hongos. No se proporcionan propiedades fisiológicas de las enzimas, ni ningún ejemplo de sus usos. Hong et al. (2003b) caracterizan CBHI de Thermoascus aurantiacus producida en levadura. No se describen aplicaciones de la enzima. Tuohy et al. (2002) describen tres formas de celobiohidrolasas de Talaromyces emersonii.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y

b) un fragmento a) que tiene actividad celulolítica.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del al menos 95% o 99% con SEQ ID NO: 6, o un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica.

3. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia que codifica un polipéptido de la reivindicación 1; b) una cadena complementaria de a) y c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético para una cualquiera de las secuencias definidas en a) o b) .

4. Un vector, que comprende como secuencia heteróloga un polinucleótido de la reivindicación 3.

5. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. Una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 16729.

7. Una preparación enzimática que comprende un polipéptido de la reivindicación 1.

8. La preparación enzimática de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente endoglucanasa y betaglucosidasa, en donde la endoglucanasa comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o un fragmento de los mismos que tiene actividad celulolítica, y la beta-glucosidasa comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o un fragmento de los mismos que tiene actividad celulolítica.

9. La preparación enzimática de la reivindicación 8, que comprende al menos una enzima adicional, preferiblemente una xilanasa, que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con SEQ ID NO: 18 o 20, o un fragmento de los mismos que tiene actividad celulolítica.

10. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, o una preparación enzimática según la reivindicación 7 en la industria de combustibles, textil, detergentes, pasta de papel y papel, alimentos, piensos o bebidas, o en el tratamiento de pasta kraft, pasta mecánica, o papel reciclado.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la preparación enzimática es medio de cultivo gastado.

12. El uso de una preparación enzimática de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 para degradar material celulósico.

13. Un método para preparar un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y

b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica,

comprendiendo dicho método transformar una célula anfitriona con un vector que codifica dicho polipéptido, y cultivar dicha célula anfitriona en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, y opcionalmente recuperar y purificar el polipéptido producido.

14. Un método de tratamiento de material celulósico con un medio de cultivo gastado de al menos un microorganismo capaz de producir un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con SEQ ID NO: 6; y

b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica, comprendiendo dicho método hacer reaccionar el material celulósico con el medio de cultivo gastado para obtener material celulósico hidrolizado.

15. Un método para el tratamiento de material celulósico con celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa, por medio del cual dicha celobiohidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con el SEQ ID NO: 6, o un fragmento del mismo que tiene actividad celulolítica.

16. El uso del método de acuerdo con la reivindicación 15 en un procedimiento para la preparación de etanol a partir de material celulósico.