TRATAMIENTO DE LESIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL.

Condroitinasa para uso en un procedimiento de promoción de plasticidad neuronal en el SNC de un mamífero

Campo de la invención

La invención se refiere a materiales y a procedimientos para el tratamiento de lesión al sistema nervioso central (SNC), en particular a procedimientos y a materiales para promover plasticidad neuronal. 5

Antecedentes

La “plasticidad” es un término que se refiere a la capacidad del sistema nervioso para cambiar las conexiones entre neuronas de manera que se altere la función del cerebro o la médula espinal, frecuentemente en respuesta a estímulos sensoriales o de comportamiento o a lesión. El término engloba la activación de sinapsis que estaban estructuralmente presentes, pero inactivas, el fortalecimiento y el debilitamiento de sinapsis y la creación y la 10 rotura de sinapsis. Se forman nuevas sinapsis mediante el brote de terminaciones nerviosas para enviar una nueva rama de la terminación a un nuevo sitio sináptico. Las sinapsis se cancelan por la pérdida de contacto de una terminación con su neurona diana, normalmente seguido de retracción de la rama de la terminación.

Después de accidente cerebrovascular, lesión de cabeza, cirugía u otros traumatismos al cerebro hay un periodo durante el cual hay una recuperación parcial de parte de la función neurológica que se ha perdido. Se cree que 15 esto es debido en gran parte a la reorganización de conexiones en la corteza y áreas subcorticales del cerebro. Por tanto, la función que solía ser realizada por la parte del cerebro que se ha perdido puede ser parcialmente asumida por la parte de cerebro superviviente. Esta reorganización de conexiones y funciones es un ejemplo de plasticidad. Un tratamiento que podría potenciar la plasticidad después de lesión cerebral, accidente cerebrovascular, enfermedad neurodegenerativa, esclerosis múltiple o cualquier otra enfermedad que produce pérdida de neuronas o conexiones 20 neuronales probablemente potenciaría la recuperación de función en pacientes, generalmente en asociación con fisioterapia y otras formas de entrenamiento.

Los inventores y otros han realizado estudios sobre regeneración axonal tras axotomía en el SNC. Estos estudios, descritos en mayor detalle más adelante, se han centrado principalmente en la médula espinal, pero también se han llevado a cabo en el tracto nigroestriatal del cerebro. Aunque se refieren a la promoción de regeneración axonal 25 y plasticidad no neuronal, estos estudios proporcionan antecedentes útiles para la invención.

Una estructura llamada la cicatriz glial se desarrolla en cualquier parte en la que el cerebro o la médula espinal esté dañado. Este proceso cicatricial reactivo implica los tipos de células de la glía astrocitos, microglia, precursores de oligodendrocitos y células meníngeas. Los axones que se cortan como resultado de lesión en el SNC dejar de regenerarse y las puntas del axón que no se regenera se encuentran en la cicatriz glial. Diversos experimentos 30 durante muchos años han demostrado que la cicatriz glial es inhibitoria de la regeneración axonal (Fawcett y Asher, 1999).

Se ha llevado a cabo una serie de experimentos in vitro para determinar qué moléculas producidas por las células de la glía en la cicatriz glial bloquean la regeneración axonal. Se mostró que las principales moléculas inhibitorias son los proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) (Smith-Thomas y col., 1994; Fawcett y Asher, 35 1999).

Los proteoglicanos de sulfato de condroitina son moléculas compuestas por un núcleo de proteína al que están unidas una o más cadenas de azúcar sulfatada largas. Las cadenas de azúcar, conocidas como cadenas de glicosaminoglicanos, están compuestas por disacáridos de repetición que consisten principalmente en N-acetilgalactosamina y ácido glucurónico. Están sulfatados en una variedad de posiciones. 40

En experimentos de cultivo de tejido se ha mostrado que la condroitinasa (que digiere las cadenas de azúcar), el clorato de sodio (que inhibe la sulfatación de las cadenas de azúcar) y los beta-D-xilósidos (que evitan que las cadenas de azúcar se unan al núcleo de proteína) hacen todos que la glía del SNC sea menos inhibitoria (Smith-Thomas y col., 1995 y otros).

También se ha mostrado que los proteoglicanos de sulfato de condroitina están regulados por incremento 45 en sitios de lesión del SNC (DeWitt y col., 1994). Desde entonces se han identificado muchos de los tipos individuales de proteoglicano y los tipos de células que los producen: NG2, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano y agrecano son proteoglicanos de sulfato de condroitina inhibitorios encontrados en lesiones del SNC (Fawcett y Asher, 1999; Fidler y col., 1999; Asher y col., 1999; Asher y col., 2000).

Basándose en los indicios en cultivo de tejido de que la eliminación de cadenas de glicosaminoglicanos 50 con condroitinasa puede hacer que los proteoglicanos de sulfato de condroitina sean menos inhibidores y en el hecho de que los proteoglicanos estén presentes en alta concentración en la cicatriz glial alrededor de lesiones del SNC, la condroitinasa se aplicó a una lesión cerebral que corta los axones del tracto nigroestriatal. El tratamiento con

condroitinasa permitió que una proporción de los axones de corte se regeneraran de nuevo a su diana (Moon y col., 2001). Similarmente, el agotamiento de precursores de oligodendritas que producen CSPG usando citosina arabinósido (un agente antimitótico) también promovió la regeneración axonal (Rhodes y col., 2000). El documento WO 91/06303 describe el uso de inhibidores de CSPG para promover el crecimiento de nervios o la migración de células de la glía.

Usando condroitinasa, la regeneración axonal también se ha mostrado in vivo en animales después de 5 lesión de médula espinal experimentalmente inducida (Bradbury y col., 2000a, 2002). Se observó la recuperación del comportamiento en pruebas de la función de las extremidades anteriores en estos animales tratados con condroitinasa (Bradbury y col., 2001). Tras la satisfactoria promoción de la regeneración axonal en el cerebro se realizó un experimento in vivo (informado en los ejemplos en este documento) en el que se administró condroitinasa a lesiones de la médula espinal usando el mismo protocolo que se había usado para los experimentos del tracto nigroestriatal. El 10 tratamiento promovió la regeneración de axones tanto sensitivos como motores y produjo la recuperación de la función del comportamiento en pruebas sensitivomotoras de la función de las extremidades anteriores (Bradbury y col., 2002). Estas pruebas de comportamiento de las extremidades anteriores se recuperan muy lentamente en ratas sin tratar.

Sin embargo, los inventores plantearon como hipótesis que la recuperación del comportamiento en animales tratados con condroitinasa era tan rápida y tan completa que la recuperación podría atribuirse al menos en 15 parte a la reorganización de las conexiones de los axones sin lesionar en la médula, es decir, la plasticidad neuronal.

En particular, los inventores plantearon como hipótesis que la gran recuperación del comportamiento observado en las tareas de caminar en barra y caminar en rejilla tras el tratamiento con condroitinasa de la médula espinal después de lesiones en la columna vertebral C4 era debida a un aumento de la plasticidad tanto como para la regeneración axonal. Las bases para esta hipótesis fueron: (1) que la cantidad de regeneración axonal tras el 20 tratamiento con condroitinasa pareció insuficiente por sí mismo para mediar en un retorno importante de la función; (2) las mejoras del comportamiento se producen espontáneamente hasta cierto grado (es decir, sin tratamiento con condroitinasa), pero durante una escala de tiempo mucho más larga que en animales tratados con condroitinasa; y (3) la sustancia gris de la médula espinal está particularmente llena de CSPG y neuronas motoras, y otras neuronas están rodeadas de redes perineuronales (concentraciones de CSPG y tenascina alrededor del soma y dendritas de neuronas). 25

Con el fin de probar adicionalmente la hipótesis, los inventores acordaron una colaboración (también informada en los ejemplos) para determinar el efecto del tratamiento con condroitinasa en un modelo animal conocido por plasticidad neuronal, el modelo de desplazamiento de la dominancia ocular. Este modelo se refiere a plasticidad en las conexiones de los ojos con la corteza visual.

Normalmente, las neuronas en una parte de la corteza visual de la rata reciben conexiones de ambos 30 ojos. La mayoría de las neuronas son accionadas igualmente de fuerte por (es decir, tienen conexiones sinápticas igualmente de fuertes a) ambos ojos. Sin embargo, en un animal de menos de 35 días, si un párpado se cierra por sutura para privarlo... [Seguir leyendo]

1. Condroitinasa para uso en un procedimiento de promoción de plasticidad neuronal en el SNC de un mamífero.

2. El uso de condroitinasa para la preparación de un medicamento para promover plasticidad neuronal en un mamífero. 5

3. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la promoción de plasticidad neuronal es promoción de plasticidad neuronal en la médula espinal o estructura cuyos somas componentes se localizan en o tienen sinapsis primarias en la médula espinal.

4. La condroitinasa o el uso de cualquier reivindicación precedente, en la que la promoción de plasticidad neuronal es tras la lesión de la médula espinal. 10

5. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 4, en la que la lesión de la médula espinal es una lesión producida por accidente, agresión, tumor, cirugía, o un disco intervertebral o anomalía ósea.

6. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la promoción de plasticidad neuronal es promoción de plasticidad neuronal en el cerebro o estructura cuyos somas componentes se localizan en o tienen sinapsis primarias en el cerebro. 15

7. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 6, en la que la promoción de plasticidad neuronal es promoción de plasticidad neuronal en la corteza.

8. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 7, en la que la promoción de plasticidad neuronal es tras accidente cerebrovascular, lesión cerebral, esclerosis múltiple o una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la corteza. 20

9. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 8, en la que dicha lesión cerebral es lesión producida por agresión, accidente, tumor o cirugía.

10. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 9, en la que dicho tumor es un tumor cerebral o un tumor no cerebral que afecta al cerebro.

11. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 8, en la que dicha enfermedad neurodegenerativa que 25 afecta a la corteza es Alzheimer.

12. La condroitinasa o el uso de la reivindicación 1 ó 2, en la que la enzima es condroitinasa ABC, condroitinasa B o condroitinasa AC.

13. Un procedimiento de identificación de un agente útil en la promoción de plasticidad neuronal, 30 comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) poner en contacto (i) un agente candidato y (ii) una sustancia seleccionada del grupo constituido por un proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG), una cadena de glicosaminoglicano de CSPG, una enzima sintética de CSPG, un sustrato de enzima sintética de CSPG, hialuronano, una enzima sintética de hialuronano y un receptor de hialuronano; 35

(b) determinar la unión entre (i) y (ii); y

(c) tras una determinación positiva de unión, ensayar el agente candidato para la capacidad para promover la plasticidad neuronal y/o para promover la recuperación funcional tras la lesión del SNC.

14. Un procedimiento de identificación de un agente útil en la promoción de plasticidad neuronal, comprendiendo el procedimiento las etapas de: 40

(a) poner en contacto (i) un agente candidato y (ii) una sustancia seleccionada del grupo constituido por CSPG, una cadena de glicosaminoglicano de CSPG e hialuronano;

(b) determinar la capacidad de (i) para digerir (ii); y

(c) tras una determinación positiva de la digestión, ensayar el agente candidato para la capacidad para promover la plasticidad neuronal y/o para promover la recuperación funcional tras la lesión del SNC. 45

15. El procedimiento de la reivindicación 13 o la reivindicación 14 que incluye adicionalmente una etapa que precede a la etapa (c) de ensayar el agente candidato para la capacidad para reducir las propiedades inhibitorias de excrecencia de neuritas y/o regeneración axonal de CSPG tras la lesión del SNC.

16. El uso de un CSPG, una cadena de glicosaminoglicano de CSPG, una enzima sintética de CSPG, un sustrato de enzima sintética de CSPG, hialuronano, una enzima sintética de hialuronano o un receptor de hialuronano en la identificación de un agente útil en la promoción de plasticidad neuronal, en el que la identificación del agente se lleva a cabo según un procedimiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

17. El procedimiento o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en el que el agente candidato 5 es un mimético de un β-D-xilósido.