Transferencia de gen mediada por vector lentiviral y usos de la misma.

Un vector lentiviral recombinante que comprende un primer gen terapéutico que reduce o inhibe la angiogénesisocular para uso en el tratamiento de degeneración macular relacionad con la edad en un individuo,

en el que dichoprimer gen terapéutico está seleccionado del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, endostatina XVIII,endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 deplasminógeno humano, la monoquina inducida por interferón-gamma (Mig), la proteína inducible por interferónalfa (IP10), FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms), y el receptor de dominio de inserción dequinasa (KDR).

Transferencia de gen mediada por vector lentiviral y usos de la misma

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular de vectores y terapia de gen. Más específicamente, la presente invención se refiere a la utilización de vectores lentivirales en terapia de gen humana para la enfermedad ocular heredada y proliferativa.

Descripción de la técnica relacionada Una de las causas más comunes de ceguera humana es la proliferación celular anormal intraocular que con frecuencia da como resultado una pérdida de claridad del eje visual, o una separación de la retina del epitelio de segmento retinal (RPE) debido a las fuerzas de tracción aplicadas directamente a la superficie retinal. El desprendimiento retinal proliferativo, si está relacionado con enfermedad diabética proliferativa (PDR) , retinopatía de prematuridad (ROP) , vitreoretinopatía proliferativa (PVR) , o degeneración macular neovascular relacionada con la edad (AMD) , si se deja sin tratar, da como resulta último una pérdida permanente de la visión.

La proliferación anormal de nuevos vasos sanguíneos en el interior del ojo, o neovascularización ocular, es la causa más común de ceguera permanente en los países desarrollados. Tres enfermedades están asociadas a la inmensa mayoría de casos de neovascularización intraocular: diabetes, retinopatía de prematuridad y degeneración macular relacionada con la edad. Aunque estas tres entidades clínicas son distintas y afectan a diferentes conjuntos de pacientes, comparten un recorrido final común que incluye la división incontrolada de células endoteliales que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos que comprometen finalmente la función retinal. En conjunto, estas condiciones suponen aproximadamente el 60% de la ceguera intratable en los Estados Unidos.

La proliferación de células endoteliales vasculares en el interior de la retina inicia el proceso de retinopatía diabética proliferativa (PDR) . Si no se trata, estas células endoteliales siguen dividiéndose y eventualmente forman membranas fibrovasculares que se extienden a lo largo de la superficie interna de la retina o por la cavidad vítrea. La contracción de la superficie vítrea posterior da como resultado una tracción en los sitios de las adhesiones vítreofibrovasculares y finalmente se desprende la retina. Aproximadamente el 50% de los diabéticos de Tipo 1 desarrollarán retinopatía diabética proliferativa dentro de los 20 años siguientes a la diagnosis de la diabetes, mientras que el 10% de los pacientes con diabetes de Tipo 2 evidenciarán retinopatía diabética proliferativa en una franja de tiempo similar.

Los vasos sanguíneos se desarrollan habitualmente mediante uno de dos procesos: vasculogénesis o angiogénesis. Durante la vasculogénesis, se establece una red primitiva de capilares durante la embriogénesis en virtud de la maduración de precursores mesenquimales multipotenciales. Por el contrario, la angiogénesis se refiere a un proceso de remodelación que incluye los vasos preexistentes. En angiogénesis, emanan brotes vasculares nuevos a partir de los vasos ya establecidos, más antiguos, e invaden el tejido circundante. En la retina, una vez que se ha establecido la red vascular normal, la remodelación de esta red está en gran medida bajo la influencia de la concentración de oxígeno del tejido; la hipoxia, o escasez de oxígeno, estimula la angiogénesis. Este proceso es el que da como resultado la ceguera en millones de diabéticos, niños prematuros o en la sociedad de mayor edad.

Las enfermedades intraoculares tales como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética proliferativa, la retinopatía de prematuridad, el glaucoma, y la vitreoretinopatía proliferativa, están por tanto caracterizados por la proliferación anormal o por otros estados para los que la terapia de gen puede ser útil. Ha sido difícil, sin embargo, realizar transducción de gen en células de mamífero con un alto grado de efectividad. Adicionalmente, se ha visto que los resultados con vectores tradicionales tales como los vectores adenovirales, los reactivos a base de liposomas y de dendrímeros, son completamente transitorios. También es problemático introducir estos vectores en el ojo sin la inducción de una fuerte respuesta inflamatoria.

De ese modo, la técnica anterior es deficiente en cuanto a la carencia de medios para transducir células humanas terminalmente diferenciadas o proliferantes en el interior del, o derivadas del ojo. La presente invención cumple esta permanente necesidad y deseo del estado actual de la técnica.

Sumario de la invención Un objeto de la presente invención consiste en desarrollar vectores lentivirales y métodos de uso de esos vectores en terapia de gen humana para la enfermedad ocular heredada y proliferativa. La utilidad de los vectores lentivirales ha sido descrita en relación con la transducción de células humanas de retina, de córnea, endoteliales vasculares, vitreoretinopáticas proliferativas y epiteliales de pigmento retinal.

En una realización de la presente invención, el potencial de supresión de la división celular intraocular mediante gen de retinoblastoma (Ca-rb) constitutivamente activo (mutante o variante) lentiviral suministrado, ha quedado demostrado. Las células oculares humanas fueron probadas in vitro, y dos modelos de enfermedad proliferativa intraocular (vitreoretinopatía proliferativa y opacificación capsular posterior de extracción post-lente) fueron probados in vivo. Una inhibición significativa y de larga duración de la división celular in vitro fue observada en muchos tipos diferentes de células. La reducción de la severidad de la vitreoretinopatía proliferativa y de la opacificación posterior de extracción post-lente, fue observada in vivo.

En otra realización de la presente invención, se ha demostrado que la transferencia de genes mediada por lentivirus que se sabe que es importante en el desarrollo y la inhibición del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis o de la muerte celular pre-programada (apoptosis) ) podía ser útil en el tratamiento de angiogénesis ocular patológica (por ejemplo, retinopatía diabética o degeneración macular “húmeda” relacionada con la edad) o la muerte celular patológica (por ejemplo, degeneración macular “seca” relacionada con la edad) . Estos genes fueron colocados bajo el control de uno de cada uno de dos promotores fuertes separados que se sabe que son activos en las células humanas de retina, córnea, y de epitelio de pigmento retinal, y se demostró la inhibición de la neovascularización de la córnea en un modelo de conejo.

Adicionalmente, este sistema de vectorización, cuando alberga genes que se sabe que son deficientes en pacientes humanos con enfermedad de ojos heredada, puede transferir genes a las células oculares humanas. La transferencia de estos genes mediante este sistema constituye la base para terapias útiles para esos pacientes con enfermedades en los ojos.

La presente invención está dirigida a un método de inhibición de la proliferación celular intraocular en un individuo que necesite un tratamiento de ese tipo, tal como un individuo que tenga una enfermedad ocular. El método comprende la etapa de: administrar a dicho individuo una dosis farmacológicamente activa de un vector lentiviral que comprende un gen terapéutico que inhibe la proliferación celular intraocular.

La presente invención está dirigida también a un método de inhibición de neovascularización intraocular en un individuo que tiene una enfermedad ocular, que comprende la etapa de: administrar a dicho individuo una dosis farmacológica efectiva de un vector lentiviral que comprende un gen terapéutico que inhibe la neovascularización intraocular.

Estos y otros aspectos, características y ventajas de la presente invención, resultarán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de las realizaciones actualmente preferidas de la invención. Estas realizaciones se proporcionan a efectos de divulgación.

Breve descripción de los dibujos De ese modo, la materia sobre la que las características, ventajas y objetos de la invención citados en lo que antecede, así como otros que resultarán claros a partir de la misma, han sido alcanzados y pueden ser comprendidos a partir de las descripciones más particulares, detalladas, de la invención, se han resumido brevemente en lo que antecede, haciendo referencia a determinadas realizaciones de la misma que se han ilustrado en los dibujos anexos. Estos dibujos forman parte de la descripción. Debe apreciarse, sin embargo, que los dibujos anexos ilustran... [Seguir leyendo]

1. Un vector lentiviral recombinante que comprende un primer gen terapéutico que reduce o inhibe la angiogénesis ocular para uso en el tratamiento de degeneración macular relacionad con la edad en un individuo, en el que dicho primer gen terapéutico está seleccionado del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 de plasminógeno humano, la monoquina inducida por interferón-gamma (Mig) , la proteína 10 inducible por interferón alfa (IP10) , FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms) , y el receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) .

2. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica la endostatina.

3. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica la angiostatina.

4. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica la endostatina XVIII.

5. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica la endostatina XV.

6. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz.

7. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica el dominio kringle 5 de plasminógeno humano.

8. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica Mig.

9. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica IP10.

10. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica FLT-1 soluble.

11. El vector lentiviral de la reivindicación 1, en el que dicho primer gen terapéutico codifica KDR.

12. El vector lentiviral de la reivindicación 1, que comprende además un segundo gen terapéutico que inhibe la angiogénesis, en el que dicho segundo gen terapéutico está seleccionado del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 de plasminógeno humano, la monoquina inducida por interferón-gamma (Mig) , la proteína 10 inducible por interferón alfa (IP10) , FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms) , y el receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) , y en el que el vector lentiviral codifica una proteína de fusión que comprende una primera secuencia de aminoácidos codificada por el primer gen terapéutico y una segunda secuencia de aminoácidos codificada por el segundo gen terapéutico.

13. El vector lentiviral de la reivindicación 1, que comprende además un segundo gen terapéutico que inhibe la angiogénesis, en el que dicho segundo gen terapéutico está seleccionado del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 de plasminógeno humano, la monoquina inducida por interferón-gamma (Mig) , la proteína 10 inducible por interferón alfa (IP10) , FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms) , y el receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) y en el que el vector lentiviral comprende un elemento de IRES (sitio de entrada de ribosoma interno) entre dicho primer gen terapéutico y dicho segundo gen terapéutico de manera que se producen, a partir de un único transcripto, una primera secuencia de aminoácidos codificada por el primer gen terapéutico y una segunda secuencia de aminoácidos codificada por el segundo gen terapéutico.

14. El vector lentiviral de la reivindicación 12, que comprende además un ligante entre la primera secuencia de aminoácidos y la segunda secuencia de aminoácidos.

15. El vector lentiviral de la reivindicación 12, en el que el vector lentiviral codifica una proteína de fusión de la endostatina XVIII y la agiostatina.

16. El vector lentiviral de la reivindicación 12, en el que el vector lentiviral codifica una proteína de fusión de la endostatina XVIII y el dominio kringle 5 de plasminógeno humano.

17. El vector lentiviral de la reivindicación 12, en el que el vector lentiviral codifica una proteína de fusión de Mig e IP10.

18. Uso de un vector lentiviral que comprende un gen terapéutico que reduce o inhibe la angiogénesis ocular en la fabricación de un medicamento para inhibir la neovascularización en un individuo que tiene una degeneración macular relacionada con la edad, en el que dicho gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en

endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 de plasminógeno humano, una proteína de fusión de endostatina y angiostatina, una proteína de fusión de endostatina y del dominio kringle 5 de plasminógeno humano, la monoquina inducida por interferón-gamma (Mig) , la proteína 10 inducible por interferón alfa (IP10) , una proteína de fusión de la Mig y la IP10, FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms) , y el receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) .

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el vector lentiviral es un vector lentiviral como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

20. Uso de la reivindicación 18, en el que dicho vector lentiviral es administrado en una dosis de entre alrededor de 106 y 109 partículas de transducción en el espacio capsular, vítreo o sub-retinal.

21. Un método para transducir ex vivo tejido corneal con un gen terapéutico, que comprende exponer una célula corneal que forma parte de un tejido corneal a un vector lentiviral recombinante que comprende dicho gen terapéutico acoplado operativamente a un promotor que se conoce que es activo en células corneales, en el que el gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 de plasminógeno humano, la monoquina inducida por interferón-gamma (Mig) , la proteína 10 inducible por interferón alfa (IP10) , FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms) , y el receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) .

22. Un tejido corneal que comprende células transducidas con un vector lentiviral recombinante, en el que el vector lentiviral recombinante comprende un primer gen terapéutico acoplado operativamente a un promotor que se conoce que es activo en células corneales, y en el que el gen terapéutico está seleccionado del grupo que consiste en endostatina, angiostatina, endostatina XVIII, endostatina XV, el dominio de hemopexina de terminal C de la metaloproteinasa-2 matriz, el dominio kringle 5 de plasminógeno humano, la monoquina inducida por interferóngamma (Mig) , la proteína 10 inducible por interferón alfa (IP10) , FLT-1 soluble (receptor de tirosina quinasa 1 similar a fms) , y el receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) .

23. El tejido corneal de la reivindicación 22, en el que las células están transducidas con un vector lentiviral como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

24. El tejido corneal de la reivindicación 22, en el que el tejido corneal es tejido corneal humano.

25. Un tejido corneal como se expone en cualquiera de las reivindicacione.

2. 24 para uso en el tratamiento de la neovascularización corneal en un individuo.

26. El tejido corneal de la reivindicación 25, en el que el tejido corneal se transduce in situ.