Transferasas y oxidorreductasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas.

Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que codifica un polipéptido que tiene actividad de Daminoácido transferasa que comprende

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 219;

(b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 220;

(c) un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 220 con una, varias o todas las modificaciones de aminoácidos como se definen en la siguiente Tabla:**Tabla**

(d) un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 220 que tiene al menos una combinación de modificaciones de aminoácidos como se establece en la siguiente Tabla**Tabla**

(e) una secuencia de ácidos nucleicos completamente complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de (a) a (d).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/088675.

Solicitante: BASF Enzymes LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3550 John Hopkins Court San Diego, CA 92121 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WEINER, DAVID, LUGINBUHL,Peter, BUENO,ANALIA, CUENCA,JOSLIN, MARASCO,ERIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/48 (en los que interviene una transferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/10 (Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/40 (contra enzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K9/00 (Péptidos de hasta 20 aminoácidos, que contienen radicales sacáridos y una secuencia totalmente determinada; Sus derivados)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/44 (Oxidoreductasas (1))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/26 (en los que interviene una oxidorreductasa)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/45 (Transferasas (2))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/38 (de Aspergillus)

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Transferasas y oxidorreductasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas.

Fragmento de la descripción:

Transferasas y oxidorreductasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas.

Campo de la invención

La invención se relaciona en general con enzimas, polinucleótidos que codifican las enzimas, el uso de tales 5 polinucleótidos y polipéptidos y más específicamente con enzimas que tienen actividad de d-aminoácido transferasa codificados por un ácido nucleico que comprende una secuencia que tiene al menos 9%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 1% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 219. Así, la invención provee enzimas, composiciones y/o métodos para la producción de péptidos, enzimas, alimentos y aditivos para alimentos, bebidas, y aditivos para bebidas, piensos y aditivos para piensos y suplementos 1 dietéticos que comprenden los polipéptidos o polinucleótidos de acuerdo con la invención.

Antecedentes

Las transferasas y/o oxidorreductasas catalizan la transferencia de un grupo químico, catalizan la transaminación, catalizan la reacción: D-alanina + 2-oxoglutarato <=> piruvato + D-glutamato, y/o catalizan una reacción de oxidación-reducción, catalizan la remoción de átomos de hidrógeno y/o catalizan la reacción: D-aminoácido + H2O + 15 aceptar <=> un 2-oxoácido + NH3 + aceptar reducido. Las transferasas, por ejemplo, las transamlnasas, por ejemplo las d-aminoácidos transferasas (también denominadas como "d-aminotransferasas" o "D-ATs"), y/o las oxidorreductasas, por ejemplo, deshidrogenasas por ejemplo, d-aminoácido deshidrogenases son de valor comercial considerable, siendo utilizadas en la industria farmacéutica, en las industrias de alimentos, piensos y bebidas, por ejemplo, para la producción de endulzantes, en la industria de madera/papel y en la industria de los combustibles. El 2 documento EP 159 268 A1 divulga una D-aminotransferasa modificada para producir (2R, 4R)-monatina que tiene alta intensidad de dulzor a partir de ácido 4(indol-3-ilmetil)-4-hidroxi-2-oxoglutárico. La entrada en la base de datos A6LX33 divulga una aminotransferasa clase IV de Clostridium beijerinckii que tiene 282 aminoácidos.

Resumen de la invención

Esta invención provee enzimas que tienen actividad de aminoácido transferasa codificadas por un ácido nucleico 25 que comprende una secuencia que contiene al menos 9%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 1% de Identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 219. La invención provee adlclonalmente enzimas que tienen actividad de d-aminoácido transferasa codificadas por un ácido nucleico que comprende una secuencia que tiene al menos 9%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 1% de Identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 219 y ácidos nucleicos que las 3 codifican, vectores y células que las comprenden, sondas para amplificar e identificar estos ácidos nucleicos que codifican transferasa, y métodos para hacer y optimizar estos polipéptidos y péptidos.

La invención provee enzimas, composiciones y/o métodos para la producción de enzimas peptídicas, alimentos y aditivos para alimentos, bebidas, y aditivos para bebidas, piensos y aditivos para piensos, suplementos dietéticos, que comprenden los polipéptidos o polinucleótidos de acuerdo con la Invención. Estas composiciones pueden ser 35 formuladas en una variedad de formas tales como tabletas, geles, píldoras, implantes, líquidos, aspersiones, películas, micelas, polvos, pellas de alimentos y piensos o como cualquier tipo de forma encapsulada.

En algunas realizaciones, las d-aminoácido transferasas y/o composiciones de las mismas pueden ser útiles en contextos farmacéuticos, industriales y/o agrícolas.

En algunas realizaciones la d-aminoácido transferasas y/o composiciones de las mismas pueden ser utilizadas para 4 catalizar una reacción entre un aminoácido y un a-cetoácido. En algunas realizaciones, las d-am¡noác¡do transferasas y/o composiciones de las mismas puedes ser útiles para catalizar una reacción de transaminación. En algunas realizaciones, las d-aminoácido transferasas y/o composiciones de las mismas pueden ser útiles para catalizar una reacción que retira el grupo amino del aminoácido dejando un a-cetoácido, y transfiriendo el grupo amino a un a-cetoácido reactivo que lo convierte en un aminoácido. En realizaciones alternativas, las d-aminoácido 45 transferasas y/o composiciones de las mismas pueden ser útiles en la producción de aminoácidos.

En algunas realizaciones se proveen d-aminoácido transferasas que facilitan la producción de indol-3-piruvato. En algunas realizaciones se proveen d-aminoácido transferasas que facilitan la producción de RR-Monatina.

En realizaciones alternativas, la invención provee polipéptidos (y los ácidos nucleicos que los codifican) que tienen actividad de d-aminoácido transferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 9%, 91%, 92%, 5 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%,o 1% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ

ID NO: 22, o una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 22 con una, varias o todas las modificaciones de aminoácidos de la Tabla 46, o una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 22 que tiene al menos una de la combinación de modificaciones de aminoácidos como se establecen en la Tabla 55, o codificadas por un ácido nucleico que comprende una secuencia que tiene al menos 9%, 91%, 92%,

93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 1% de identidad de secuencia a la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 219. En realizaciones alternativas, la invención provee polipéptidos (y los ácidos nucleicos que los codifican) que tienen una actividad de d-aminoácido transferasa como se definió anteriormente pero que carece de una secuencia de señalización, un preprodominio un dominio de enlazamiento; y en un aspecto, consiste de un dominio de enlazamiento de NAD, NAD(P), calcio, tiamina, FAD, zinc, ADN y/o a lipoilo.

En realizaciones alternativas, la invención provee polipéptidos (y los ácidos nucleicos que los codifican) que tienen una actividad de d-aminoácido transferasa que comprende adicionalmente una secuencia heteróloga; y en un aspecto, la secuencia heteróloga comprende, o consiste de una secuencia que codifica: (i) una secuencia de señalización heteróloga, un dominio heterólogo, un dominio de enlazamiento heterólogo, un dominio de ordenamiento heterólogo, un dominio catalítico heterólogo (CD), o una combinación de los mismos; (¡i) la secuencia de (i), en donde la secuencia de señalización heteróloga, el dominio de enlazamiento o el dominio catalítico (CD) son derivados de una enzima heteróloga; o (i¡¡) una etiqueta, un epítopo, un péptido de direccionamiento, una secuencia escindióle, una unidad estructural detectable o una enzima; y en un aspecto, el dominio de enlazamiento heterólogo comprende, o consiste de, un dominio del enlazamiento de NAD, NAD(P), calcio, tiamina, FAD, zinc, ADN y/o un lipoilo; y en un aspecto, la secuencia de señal heteróloga direcciona la proteína codificada a una vacuola, al retículo endoplasmático, un cloroplasto o un gránulo de almidón.

La invención provee ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden

(a) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica al menos un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 9%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 1% de identidad de secuencia a la secuencia de ácido nucleico (polinucleótido) de SEQ ID NO:219 en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de d-aminoácido transferasa (b) el ácido nucleico (polinucleótido) de (a), en donde las identidades... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que codifica un polipéptido que tiene actividad de D- aminoácido transferasa que comprende

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 9%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o

1% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 219;

(b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 22;

(c) un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 22 con una, varias o todas las modificaciones de aminoácidos como se definen en la siguiente Tabla:

Nombre del mutante

Mutación

Nombre

del

mutante

Mutación

Y6L

92

D2G

Y6C; MUTACION SILENCIOSA AT AA31 (GGC - GGT)

93

D2Q

Y6F

94

D2F

Y6L

95

D2A

Y6H

96

D2T

Y6L

97

D2N

Y6M

98

D2R

N1S

99

D2I

N1W

1

D2V;G9A

N1T

11

G12A

N1R

12

D47W

N1T

13

S56S

L14V

14

I64H

L14L

15

L66L

G41G

16

I64C

T18W

17

L66G

N4N

18

E69Y

V19T

19

T74L

V42V

11

K73L

I62C

111

T74V

V82A

112

T74M

A57M

113

T74R

V42M

114

T74A

G41Y

115

N76C

Nombre del muíante

Mutación

Nombre

del

mutante

Mutación

A45L

116

E77R

V93Y

117

R156A

V93G

118

K72M

L46A

119

S25A

L46H

12

Q29S

G98A

121

V212E

P2S

122

R213W

V93A

123

I216T

V13T

124

P217H

P18F

125

P217V

V93L

126

D219F

S11S

127

E22V

A16G

128

R221E

S11Q

129

F223C

P18T

13

S226P

N118G

131

L228F

P18G

132

V234A

I12L

133

S238S

A16W

134

V236T

N118R

135

V236T

N11A; N118G

136

T241R

N118A

137

L242F

N118R

138

T241R

P117W; N118K

139

T241C

D133N

14

E248F

K126Q

141

D25E

51

K126R

142

K257V

52

K128S

143

G256K

53

I127M

144

E26G

54

T131T

145

L262R

Nombre del muíante

Mutación

Nombre

del

mutante

Mutación

D133L

146

K263M

56

M132A

147

D267G

57

D133E

148

D267R

58

L129V

149

1265L

59

K126K

15

E268S

I13M

151

L27S

61

M132Y

152

L27G

62

K128R

153

L27W

63

M132R

154

R271S

64

L129I

155

I274W

K128L; D2D (GAC ^ GAT)

156

G278S

66

F137W

157

Y279C

67

I152V

158

S284R

68

N55L

159

E282G

69

N15S

16

T28N

7

L138L

161

V286G

71

P149P

162

R285F

72

G161G

163

V286R

73

A165T

164

G24G

74

H163R

165

E61R

75

H163K

166

E61D

76

H168A

167

E61Y

77

E171S

168

G85G

78

E171R

169

G85D

79

E171R

17

S8R

8

T172I

171

Y79R

81

C176G

172

Y79V

82

A177S

173

W283V

83

A177S

174

W283E

84

S8L; R156W

175

W283A

Nombre del mutante

Mutación

Nombre

del

mutante

Mutación

85

H182G

176

W283S

86

N186S

177

W283G

87

K185R

178

W283A

88

K185T

179

W283R

89

D2H

18

W283T

9

D2T; E25G

181

P281W

91

D2Y

182*

V236T;

T241R

(d) un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 22 que tiene al menos una combinación de modificaciones de aminoácidos como se establece en la siguiente Tabla:

Número/designación

Mutación

Número/designación

Mutación

P2S-N118G

P2S-N11A-N118G

T74V-V93G-L27W

N11A-N118G-T241R-L27W

P2S-T74V-L27W

P2OS-T74V-V93G-N11A-N118G-V236T-L27W

T74V-L27W

V93G-N11AN113G-V236T

P2S-K73L-T241R-L27W

P2S-T74V-N11A-N118G

K73 L-V93G-V236T-T241R

N11A-N118G

P2S-T7 4 V-V236T

P2S -V93G-N11AN118G-T241R

P2S-K73L-V93G

N11A-N118A-L27W

K73L-V236T

P2S-N11A-N118G-L27W

P2S-L27W

N11A-N118A-V236T-T241R

2N-P2S-K73L-V93G-N118G

NI 1A-N118G-L27W

P2S-T74V-N118A

V93G-N11AN118G-T241R

P2S-V236T

P2S-V93G-N11AN118G

P2S-T241R-L27W

V93G-N11A

P2S-T241R

P2S-N11A-N118G-V236T

T74V-V93G-V236T-T241R

T74-V-N11A-N118A-V236T

P2S-K73L-T74V-L27W

P2S-K73L-T74V-N11A-N118G-V236T-T241R

P2S-V93G-V236T

66E ¡SILENT GAG-* GAA)-N11A-N118A-V236T

P2S-K73L-T74V-T241R-L27W

T74V-N18G

P2S-K73 L-L27 GW

P2S-T241R-L27W-277T (SILENT ACA » ACG)

T74V-V93G-N118G-V236T-T241R

T74V-N118-A-L27W

P2S-K73L-21A (SILENT-GCC -* GCT)-V23ST

51

P2S-K73L-N118A-L27W

N118A-L27W

52

P2S-V93G-T241R

P2S-56K (SILENT AAG -> AAA)-L27W

53

T74V-V93G-N11A-T241R

P2GS-V93 G-N118G

54

V93G-N11A-N118 A

P2S-V236T-T241R

P2S-T74V-V93G-N11A-M 18G-T241R

P2QS-P117W-N118A-V236T-L27W

56

T74V-N11A-N118G-L27W

V93G-V236T

57

P2S-231A (SILENT GCG GCA)-V236T

V236T-L27W

58

V93G-V236T-T241R

P2S-N118G-L27ÜW

; o

(e) una secuencia de ácidos nucleicos completamente complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de (a) a (d).

2. Un casete de expresión, un vector o un vehículo de clonación que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de 5 la reivindicación 1, en donde el vehículo de clonación comprende un vector viral, un plásmido, un fago, un fagélido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial, en donde el vector viral comprende un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adenoasociado, o, el cromosoma artificial comprende un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un vector derivado de bacteriófago Pl (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o un cromosoma artificial de mamífero (MAC).

3. Una célula transformada que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 1, o el casete de

expresión, vector vehículo de clonación de la reivindicación 2, en donde la célula es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, o una célula de insecto, o una célula vegetal.

4. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante que tiene una actividad de D-aminoácido transferasa que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene 9%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 1% de

identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;

(b) una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO: 22 con una, varias o todas las modificaciones de aminoácidos de la siguiente Tabla:

Nombre del mutante

Mutación

Nombre del mutante

Mutación

Y6L

92

D2G

Y6C; MUTACION SILENCIOSA AT AA31 (GGC - GGT)

93

D2Q

Y6F

94

D2F

Y6L

95

D2A

Y6H

96

D2T

Y6L

97

D2N

Y6M

98

D2R

Nombre del muíante

Mutación

Nombre del mutante

Mutación

N1S

99

D2I

N1W

1

D2V;G9A

N1T

11

G12A

N1R

12

D47W

N1T

13

S56S

L14V

14

I64H

L14L

15

L66L

G41G

16

I64C

T18W

17

L66G

N4N

18

E69Y

V19T

19

T74L

V42V

11

K73L

I62C

111

T74V

V82A

112

T74M

A57M

113

T74R

V42M

114

T74A

G41Y

115

N76C

A45L

116

E77R

V93Y

117

R156A

V93G

118

K72M

L46A

119

S25A

L46H

12

Q29S

G98A

121

V212E

P2S

122

R213W

V93A

123

I216T

V13T

124

P217H

P18F

125

P217V

V93L

126

D219F

S11S

127

E22V

A16G

128

R221E

S11Q

129

F223C

Nombre del muíante

Mutación

Nombre del mutante

Mutación

P18T

13

S226P

N118G

131

L228F

P18G

132

V234A

I12L

133

S238S

A16W

134

V236T

N118R

135

V236T

N11A; N118G

136

T241R

N118A

137

L242F

N118R

138

T241R

P117W; N118K

139

T241C

D133N

14

E248F

K126Q

141

D25E

51

K126R

142

K257V

52

K128S

143

G256K

53

I127M

144

E26G

54

T131T

145

L262R

D133L

146

K263M

56

M132A

147

D267G

57

D133E

148

D267R

58

L129V

149

1265L

59

K126K

15

E268S

I13M

151

L27S

61

M132Y

152

L27G

62

K128R

153

L27W

63

M132R

154

R271S

64

L129I

155

I274W

K128L; D2D (GAC ^ GAT)

156

G278S

66

F137W

157

Y279C

67

I152V

158

S284R

68

N55L

159

E282G

69

N15S

16

T28N

Nombre del muíante

Mutación

Nombre del muíante

Mutación

7

L138L

161

V286G

71

P149P

162

R285F

72

G161G

163

V286R

73

A165T

164

G24G

74

H163R

165

E61R

75

H163K

166

E61D

76

H168A

167

E61Y

77

E171S

168

G85G

78

E171R

169

G85D

79

E171R

17

S8R

8

T172I

171

Y79R

81

C176G

172

Y79V

82

A177S

173

W283V

83

A177S

174

W283E

84

S8L; R156W

175

W283A

85

H182G

176

W283S

86

N186S

177

W283G

87

K185R

178

W283A

88

K185T

179

W283R

89

D2H

18

W283T

9

D2T; E25G

181

P281W

91

D2Y

182

V236T;

T241R

(c) una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO: 22 que tiene al menos una de las combinaciones de modificaciones de aminoácidos como se definen en la siguiente Tabla:

Número/designación

Mutación

Número/designación

Mutación

P2S-N118G

P2S-N11A-N118G

T74V-V93G-L27W

N11ÜA-N118G-T241R-L27W

P2S-T74V-L27W

P2S-T74V-V93G-N11A-N116G-V236T-L27W

T74V-L27W

V93G-N11AN118G-V236T

P2S-K73L-T241R-L27W

P2S-T74V-N11A-N118G

Número/designación

Mutación

Número/designación

Mutación

K73L-V93G-V236T-T241R

N11A-N118G

P2S-T74V-V236T

P2S -V93G-N11AN118G-T241R

P2S-K73L-V93G

N11A-N11BA-L27ÜW

K73L-V236T

P2S-N11A-N118G-L27QW

P2DS-L27W

N11A-N118A-V236T-T241R

2N-P2S-K73L-V93G-N113G

N11A-N11BG-L27W

P2S-T74V-N118A

V93G-N11AN118G-T241R

P2S-V236T

P2S-V93G-N11AN118G

P2S-T241R-L27W

V93G-N11A

P2S-T241R

P2S-N11A-N118G-V236T

T74V-V93G -V236T-T241R

T74V-N11ÜA-N118A-V236T

P2S -K73L-T74V-L27W

P2S-K73L-T74V-N11A-N118G-V236T-T241R

P2S-V93G-V236T

86E (SILENT GAG-> GAA)-N 11A-N118A-V236T

P2S-K73L-T74V-T241R-L27W

T74V-N18G

P2S-K73L-L27W

P2S-T241R-L27W-277T (SILENT ACA-» ACG)

T74V-V93G-N118G-V236T-T241R

T74V-N118-A-L27W

P2S-K73L-21GA (SILENT-GCC -* GCT)-V236T

51

P2S-K73L-N118A-L27W

N11BA-L27ÜW

52

P2S-V93G-T241R

P2S-58K (SILEMTAAG -»AAAK27W

53

T74V-V93G-N11A-T241R

P2GS-V93G-N118G

54

V93G-N11A-N11SA

P2ÜS-V236T-T241R

P2S-T74V-VS3G-N11A-N118G-T241R

P2S-P117W-N11BA-V236T-L27W

56

T74V-N11A-M11BG-L27W

V93G-V236T

57

P2S-231A (SILENT GCG GCA)-V236T

V236T-L27W

58

V93G-V236T-T241R

P2ÜS-N118G-L27W

; o

(d) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 1.

5. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 4, en donde la preparación de proteína 5 comprende un líquido, un sólido o un gel.

6. Un método para producir un polipéptido recombinante de la reivindicación 4 que comprende las etapas de:

(a) proveer el ácido nucleico de la reivindicación 1; y

(b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido, produciendo por lo tanto un polipéptido recombinante, y opcionalmente el método comprende transformar una célula anfitriona con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido por la expresión del ácido nucleico de la etapa (a), produciendo por lo tanto un polipéptido recombinante en una célula transformada.

7. Un método para generar una variante del ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(a) proveer ácido nucleico plantilla que comprende la secuencia de cualquiera de las reivindicación 1; y

(b) modificar, eliminar o agregar uno o más nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla,

en donde opcionalmente el método comprende adicionalmente expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido variante de transferasa por ejemplo, transaminasa, por ejemplo, D-aminoácido transferasa, y/o oxidorreductasa, por ejemplo, deshidrogenasa, por ejemplo, D-aminoácido deshidrogenasa,

y opcionalmente, las modificaciones, adiciones o eliminaciones son introducidas por un método que comprende PCR propenso al error, mezcla, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por casete, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponencial, mutagénesis dirigida al sitio, reensamblaje de genes, mutagénesis por saturación en el sitio del gen (GSSM), reensamblaje por ligazón sintética (SLR) y una combinación de los mismos, o, las modificaciones, adiciones o eliminaciones son introducidas por un método que comprende recombinación, recombinación de secuencias recursiva, mutagénesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con brecha, mutagénesis de reparación de punto de no coincidencia, mutagénesis de cepa anfitriona deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por eliminación, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de ácidos nucleicos y multímeros quiméricos y una combinación de los mismos,

en donde opcionalmente, el método es repetido iterativamente hasta que una transferasa por ejemplo, a transaminasa, por ejemplo, una d-aminoácido transferasa, y/o una oxidorreductasa, por ejemplo, a deshidrogenasa, por ejemplo, una d-aminoácido deshidrogenasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la del polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla se produce,

en donde opcionalmente el polipéptido variante de la transferasa por ejemplo, transaminasa, por ejemplo, D- aminoácido transferasa, y/o oxidorreductasa, por ejemplo, deshidrogenasa, por ejemplo, D-aminoácido deshidrogenasa es termotolerante, y retiene alguna actividad después de ser expuesto a una temperatura elevada, o, opcionalmente el polipéptido variante de la transferasa por ejemplo, transaminasa, por ejemplo, D-aminoácido transferasa, y/o oxidorreductasa, por ejemplo, deshidrogenasa, por ejemplo, D-aminoácido deshidrogenasa tiene glicosilación incrementada en comparación con la transferasa por ejemplo, la transaminasa, por ejemplo, la d- aminoácido transferasa, y/o la oxidorreductasa, por ejemplo, la deshidrogenasa, por ejemplo, la d-aminoácido deshidrogenasa codificada por un ácido nucleico de plantilla, u opcionalmente, el polipéptido variante de transferasa por ejemplo, transaminasa, por ejemplo, d- aminoácido transferasa, y/o oxidorreductasa, por ejemplo, deshidrogenasa, por ejemplo, D-aminoácido deshidrogenasa tiene una actividad de transferasa por ejemplo, una actividad de transaminasa, por ejemplo, una actividad de D-aminoácido transferasa or una actividad de w- transaminasa, y/o una actividad de oxidorreductasa, por ejemplo, una actividad de deshidrogenasa, por ejemplo, una actividad de D-aminoácido deshidrogenasa bajo una alta temperatura, en donde la transferasa, por ejemplo, la transaminasa, por ejemplo, la d-aminoácido transferasa, y/o la oxidorreductasa, por ejemplo, la deshidrogenasa, por ejemplo, la d-aminoácido deshidrogenasa codificada por el ácido nucleico de plantilla no es activa bajo la alta temperatura,

en donde opcionalmente, el método es repetido iterativamente hasta que una secuencia de codificación de transferasa, por ejemplo, a transaminasa, por ejemplo, una d-aminoácido transferasa, y/o una oxidorreductasa, por ejemplo, a deshidrogenasa, por ejemplo, una d-aminoácido deshidrogenasa que tiene un uso de codón alterado con respecto al del ácido nucleico de plantilla es producido,

en donde opcionalmente el método es repetido iterativamente hasta que un gen de transferasa, por ejemplo, a transaminasa, por ejemplo, una d-aminoácido transferasa, y/o una oxidorreductasa, por ejemplo, a deshidrogenasa, por ejemplo, una d-aminoácido deshidrogenasa que tienen un nivel más alto o más bajo de expresión de mensaje o estabilidad con respecto al ácido nucleico de plantilla es producido.

8. Una bebida o precursor de bebida que comprende el polipéptido de la reivindicación 4.

9. Un pienso, alimento, aditivo para alimento o pienso, suplemento para alimento o pienso, o auxiliar dietario o suplemento dietario que comprende el polipéptido de la reivindicación 4, en donde opcionalmente el alimento, pienso, aditivo para alimento o pienso, suplemento para alimento o pienso, o auxiliar dietario comprende

adicionalmente un vehículo seleccionado del grupo consistente de un germen de grano, un germen de grano que carece de aceite, un heno una alfalfa, un fleo, una corteza de soja, una torta de semilla de girasol y un midd de trigo,

y opcionalmente un vehículo comprende un germen de grano que carece de aceite, u opcionalmente, la enzima transferasa, por ejemplo, the transaminasa, por ejemplo, la d-aminoácido transferasa, y/o la oxidorreductasa, por ejemplo, la deshidrogenasa, por ejemplo, la d-aminoácido deshidrogenasa es glicosilada para proveer termoestabilidad en condiciones de peletización, y opcionalmente la matriz de administración es formada por peletización de una mezcla que comprende un germen de grano y una transferasa, por ejemplo, a transaminasa, por ejemplo, una d-aminoácido transferasa, y/o una oxidorreductasa, por ejemplo, a deshidrogenasa, por ejemplo, una d-aminoácido deshidrogenasa, y opcionalmente las condiciones de peletización incluyen la aplicación de vapor, y opcionalmente las condiciones de peletización comprenden la aplicación de una temperatura por encima de aproximadamente 8°C durante aproximadamente 5 minutos y la enzima retiene una actividad específica de al menos 35 hasta aproximadamente 9 unidades por miligramo de enzima.

1. Un método para hacer un plruvato y/o un D-glutamato que comprende

(a) proveer una D-alanlna y un 2-oxoglutarato;

(b) proveer el polipéptido de la reivindicación 4; y

(c) poner en contacto el polipéptido de (b) con la D-alanina + 2-oxoglutarato bajo condiciones en donde el polipéptido cataliza la reacción D-alanlna + 2-oxoglutarato <=> piruvato + D-glutamato.

11. Un método para hacer un 2-oxo ácido que comprende

(¡)

(a) proveer un D-aminoácido + H2O + aceptor;

(b) proveer el polipéptido de transaminasa de la reivindicación 4; y

(c) poner en contacto el polipéptido de (b) con el D-aminoácido + H2O + aceptor, bajo condiciones en donde el polipéptido cataliza la reacción: D-aminoácido + H2 + aceptor <=> un 2-oxo ácido + NH3 + aceptor reducido; o

(ii) el método de (I), en donde el aceptor es una benzoquinona es (iii) el método de (¡I) en donde la benzoquinona es una 1,2-benzoqulnona o una 1,4-benzoquinona, o ubiqulnona, ubldecarenona o coenzima Q.

12. Un método para transferir un grupo amino de un aminoácido a un alfa-cetoácido que comprende

(¡)

(a) proveer un aminoácido;

(b) proveer el polipéptido de transaminasa de la reivindicación 4; y

(c) poner en contacto el polipéptido de (b) con el aminoácido bajo condiciones en donde el polipéptido cataliza la conversión del aminoácido a un alfa-cetoácido; o

(ii) el método de (I), en donde la actividad de transaminasa comprende catalizar la conversión de una mezcla de aminoácidos racémica a un alfa-cetoácido de manera sustancial ópticamente puro.

13. Un método para hacer un aminoácido a partir de una alfa-cetoácido que comprende

(i)

(a) proveer un alfa-cetoácido

(b) proveer el polipéptido de la reivindicación 4; y

(c) poner en contacto el polipéptido de (b) con el alfa-cetoácido bajo condiciones en donde el polipéptido cataliza la conversión del alfa-cetoácido a un aminoácido;

(ii) el método de (I), en donde el polipéptido de la reivindicación 4 comprende catalizar la conversión de una mezcla alfa-ceto racémica a un D- o L-aminoácido sustancialmente puro ópticamente; o

(iii) el método de (i) o (¡i), en donde el oxaloacetato es convertido a un aspartato, o el alfa-cetoglutarato es convertido a glutarato, o un alfa-cetoisovalerato es convertido a una L-valina; o la actividad de transaminasa es una actividad de transaminasa omega que cataliza la conversión de isobutilamina a isobutilaldehído.

14. Un método para catalizar la conversión de una amina a una cetona que comprende

(¡)

(a) proveer una amina;

(b) proveer el polipéptido de la reivindicación 4; y

(c) poner en contacto el polipéptido de (b) con la amina bajo condiciones en donde el polipéptido cataliza la conversión de una amina a una acetona, en donde la amina no es o no proviene de un triptófano (con la condición de que el segundo aminoácido no es triptófano, o con la condición de que la amina no es o no proviene de un triptófano);

(ii) el método de (i), en donde la actividad de transaminasa comprende catalizar la conversión de una amina quiral a una cetona; o

(iii) el método de (i) o (ii), en donde la amina es una cu-amina.

15. Un método para catalizar la síntesis de un aminoácido que comprende

(¡)

(a) proveer un aminoácido y un cetoácido, donde el aminoácido no es triptófano;

(b) proveer el polipéptido de transaminasa de la reivindicación 4; y

(c) poner en contacto el polipéptido de (b) con el aminoácido y el cetoácido bajo condiciones en donde se produce un segundo aminoácido y un piruvato, en donde el segundo aminoácido no es triptófano (con la condición de que el segundo aminoácido no es triptófano); o

(ii) el método de (i), que comprende adicionalmente hacer reaccionar el piruvato con una enzima acetolactato sintasa bajo condiciones apropiadas para producir un compuesto que no reacciona con la enzima transaminasa;

(iii) el método de (ii), en donde el compuesto que no reacciona con la enzima transaminasa es acetolactato o acetoina; o, el primer aminoácido es alanina o L-aspartato; o, el cetoácido es 2-cetobutirato o trimetil piruvato; o, el segundo aminoácido es 2-aminobutirato o tert-leucina.

16. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde el polipéptido carece de una secuencia de señalización, carece de un preprodominio, o carece de un dominio de enlazamiento.

17. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde el polipéptido comprende adicionalmente una secuencia heteróloga.

18. El polipéptido de la reivindicación 17, en donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación o comprende adicionalmente un polisacárido, en donde opcionalmente la glicosilación es una glicosilación enlazada a N, y opcionalmente el polipéptido es glicosilado después de ser expresado en una P.pastoris o en una S.pombe.

19. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde la secuencia de aminoácidos es un fragmento enzim ática mente activo de SEQ ID NO: 22 y el fragmento tiene una actividad de D-aminoácido transferasa.