Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.

Se describe la secuencia genética de las tiorredoxina m cloroplástica de la especie N. tabacum, su método de clonación, expresión en plastidios y aplicaciones. Se proporcionan además los vectores de transformación plastidial que contienen moléculas de ADN que codifican Trx m, los hospedadores que los incorporan, especialmente E. coli y, particularmente, plantas transgénicas obtenidas con tales vectores, así como su método de obtención y su aplicación en la sobreexpresión de Trx m en forma soluble y activa en dichas plantas.

Los citados vectores plastidiales se aplican a la producción plastidial incrementada de proteínas heterólogas recombinantes, fusionadas con las secuencias de Trx m, concretamente albúmina sérica (HSA) y cardiotrofina-1 (hCT1) humanas. Se describen también métodos de obtención de proteínas heterólogas coexpresadas con Trx m, biológicamente activas y en conformación nativa; así como la obtención de hCT1 recombinante en forma soluble y con bioactividad incrementada.

Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la Biotecnología, y específicamente a la secuencias genética de la tiorredoxina (Trx) ceroplástica m de la especie N. tabacum, su método de clonación, expresión en plastidios y aplicaciones. La invención proporciona además los vectores de transformación plastidial que contienen moléculas de ADN que codifican Trx m, los hospedadores que los incorporan y, particularmente, plantas transgénicas obtenidas con tales vectores, así como su método de obtención y su aplicación a la sobreexpresión de Trx m en forma soluble y activa en dichas plantas.

La invención se aplica además a la producción plastidial incrementada de proteínas heterólogas recombinantes, fusionadas con las secuencias de Trx m, concretamente albúmina sérica (HSA) y cardiotrofina-1 (hCT1) humanas. Se describen también métodos de obtención de proteínas heterólogas coexpresadas con Trx m, biológicamente activas y/o en su conformación nativa; así como la obtención de hCT1 recombinante con bioactividad incrementada.

Antecedentes de la invención

Las tiorredoxinas son pequeñas proteínas termoestables (12 kDa) presentes en todos los organismos que catalizan intercambios tiol-disulfuro y regulan el ambiente redox de la célula, controlando un amplio rango de procesos bioquímicos. Esta regulación depende, en la mayoría de los casos, de la capacidad de las tiorredoxinas de reducir puentes disulfuro de proteínas diana. En plantas, el sistema tiorredoxina es particularmente complejo, ya que existen múltiples isoformas y múltiples genes que codifican para cada tipo de tiorredoxina; siendo todos estos genes codificados nuclearmente, independientemente de su localización subcelular.

La multiplicidad de isoformas de tiorredoxinas encontradas en cloroplastos de Arabidopsis thaliana, cuatro isoformas de tiorredoxina m, dos f, una x, y dos y hace que surjan dudas respecto a la especificidad y las funciones de las mismas. Las tiorredoxinas más estudiadas hasta la fecha han sido las tiorredoxinas m y f, por ser las únicas asociadas a la regulación dependiente de la luz del metabolismo del carbono, a través del ciclo de las pentosas fosfato y del ciclo C₄.

Las tiorredoxinas cloroplásticas se denominaron m y f en función de la enzima que son capaces de activar, la NADP-malato deshidrogenasa (NADP-MDH) y la fructosa-1,6-bis-fosfatasa (FBPasa) respectivamente. Estudios filogenéticos y comparaciones estructurales han demostrado que las tiorredoxinas m tienen un origen procariota, están codificadas nuclearmente y se encuentran asociadas débilmente a las membranas externas del tilacoide. Las tiorredoxinas f están también codificadas nuclearmente y tienen un origen eucariota.

Las tiorredoxinas cloroplásticas pueden regular procesos tan importantes como: el ciclo de Calvin; el ciclo C4; el metabolismo del nitrógeno y del azufre; la biosíntesis de ácidos grasos, isoprenoides, tetrapirroles y vitaminas; la traducción; el ciclo de las pentosas fosfato; el estrés oxidativo; el ensamblaje/plegado de proteínas y degradación de las mismas; la degradación del almidón; la glicólisis; la división plastidial y la replicación del DNA. Recientemente se ha descrito la existencia de un completo sistema ferredoxina/tiorredoxina también en amiloplastos, regulando la actividad de enzimas implicadas en procesos tales como el metabolismo del almidón; la biosíntesis de lípidos, aminoácidos y nucleótidos; el plegado de proteínas y otras reacciones varias.

A pesar de la existencia de múltiples estudios sobre la estructura de las tiorredoxinas cloroplásticas, sus funciones y su regulación en la planta, es difícil conocer qué tiorredoxina actúa en cada proceso in vivo, debido a la pérdida de especificidad de las tiorredoxinas m y f mutadas usadas en proteómica y cromatografía de afinidad.

Transformación plastidial

La información genética de las plantas se encuentra distribuida en tres compartimentos celulares: el núcleo, las mitocondrias y los plastidios. El genoma plastidial (plastoma) es circular de doble hélice, y en plantas superiores difiere en tamaño según la especie entre 120 y 160 kb. El número de copias del plastoma en el plastidio es variable, dependiendo del tipo de plastidio y del tipo de célula, pudiendo llegar a contener hasta 10.000 copias en una célula del mesófilo de la hoja.

En el proceso de transformación plastidial, la integración del ADN en el genoma plastidial se produce por recombinación homologa. Se han probado hasta 14 lugares distintos de inserción en los que no ha habido efectos negativos, si bien los más utilizados han sido la región intergénica del trnI-trnA y la del rrn16/trnV-rps7/12. El método más utilizado para insertar los vectores en el ADN plastidial ha sido el bombardeo con helio a alta presión (método biolístico). Para detectar la regeneración de transformantes se suelen utilizar marcadores de selección. El más eficiente hasta el momento ha sido el gen aadA de bacterias, que codifica la enzima 3'-adenilil-transferasa, y es capaz de inactivar antibióticos tipo aminoglicósidos, como la espectinomicina y la estreptomicina.

Para lograr grandes niveles de acumulación de proteína recombinante, los transgenes se expresan bajo promotores constitutivos fuertes que aseguran altos niveles de ARNm. También se suelen incluir regiones 5'UTR que promuevan una traducción activa y estabilicen los transgenes. La elección de estos elementos resulta crucial para determinar las cantidades finales de acumulación de proteína, pues el inicio de la traducción es el paso limitante. En cambio, la región 3'UTR es importante para estabilizar el ARNm y no parece influir en el nivel de expresión de los transgenes.

La transformación plastidial presenta una serie de ventajas, incluida la capacidad de obtener elevados niveles de expresión de la proteína recombinante, pudiendo llegar a alcanzar hasta el 46% de la proteína soluble total, debido probablemente al elevado número de copias del transgén en la célula. Otras ventajas destacables son: la ausencia de "efecto posición", permitiendo una expresión uniforme y reproducible del gen; la baja probabilidad en el flujo de transgenes a otros cultivos o especies salvajes relacionadas, ya que en la mayoría de las especies cultivadas los plastomas son heredados por vía materna; y la capacidad de procesamiento policistrónico, que los capacita para procesar varios transgenes bajo el control de un único promotor.

Las aplicaciones biotecnológicas de la transformación plastidial son amplias (Bock et al, 2001, Trends Biotech. 22, 311-318; Maliga, 2004, Annu. Rev. Plant. Biol. 55, 289-313). Por una parte, han sido numerosos los estudios para dotar de ventajas agronómicas a los cultivos, como resistencia a insectos o a herbicidas y fitorremediación. También se ha publicado la expresión de moléculas de interés industrial como la xilanasa, trehalosa o el PHB. En una revisión (Heifetz, 2000, Biochim. 82, 655-666), se recogen además otros trabajos de expresión plastidial que ya han sido patentados (E5 celulasa, aprotinina bovina y tolerancia a herbicidas norflorazon y bromoxynil). La aplicación más extendida ha sido la producción de compuestos biofarmacéutícos en plastidios, probablemente porque las expectativas de mercado son altas y pueden esperarse grandes beneficios (Bock, 2007 Curr. Opin. Biotechnol. 18, 100-106; Daniell, 2006, Biotech. J. 1, 1071-1079).

Sobreexpresión de Trx recombinantes en plantas

Existen muy pocos trabajos en los que se han sobreexpresado tiorredoxinas en plantas. Cho et al (Cho et al, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14641-14646) sobreexpresaron una tiorredoxina h de trigo en el endospermo de cebada transgénica, obteniendo un incremento de hasta 4 veces en la actividad de la "starch-debranching enzyme", enzima que rompe de manera específica los enlaces alfa-1,6 en el almidón, en el endospermo de granos transgénicos germinados. También se ha visto que se aceleraba la emergencia de la radícula durante el proceso de germinación (Wong et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16325-16330). Asimismo, se ha descrito que la sobreexpresión de tiorredoxina h en cereales (trigo y cebada) puede utilizarse para mejorar la calidad harino-panadera... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una tiorredoxina, seleccionada del grupo que consiste en:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que es idéntica, al menos en un 90%, a la secuencia SEQ ID Nº:7;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica, al menos en un 90%, a la secuencia, SEQ ID Nº: 6 o SEQ ID Nº:8.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende la secuencia SEQ ID Nº: 7.

3. Polipéptido purificado, codificado por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, cuya secuencia comprende una secuencia idéntica, al menos en un 90%, a SEQ ID Nº:6 o SEQ ID Nº: 8.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, que comprende la secuencia SEQ ID Nº: 6.

5. Polipéptido según la reivindicación 3, que comprende la secuencia SEQ ID Nº: 8.

6. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Vector de expresión según la reivindicación 6, que comprende adicionalmente secuencias de recombinación homologa que permiten dirigir la inserción en el genoma plastidial de los fragmentos de ADN comprendidos entre ellas.

8. Vector de expresión según la reivindicación 7, que comprende el fragmento de ácido nucleico codificante representado por codón de inicio ATG unido a SEQ ID Nº:7.

9. Vector de expresión según la reivindicación 8, en el que el fragmento de ácido nucleico codificante está unido operativamente a un promotor constitutivo endógeno plastidial y a una secuencia inductora de la traducción.

10. Vector de expresión según la reivindicación 9, en el que el fragmento de ácido nucleico codificante está unido operativamente a la secuencia promotora y a la secuencia 5'UTR del gen psbA plastidial de Nicotiana tabacum.

11. Vector de expresión según la reivindicación 9, en el que el fragmento de ácido nucleico codificante está unido operativamente al promotor Prrn y a la secuencia del sitio de unión al ribosoma (RBS) de la región líder del gen 10 del bacteriófago T7 (G10L).

12. Vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, que es un derivado del plásmido pL3.

13. Vector de expresión según la reivindicación 12, que es el plásmido pL3psbATRXm.

14. Vector de expresión según la reivindicación 12, que es el plásmido pL3PrmG10LTRXm.

15. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que al fragmento de ácido nucleico codificante representado por SEQ ID Nº:7, se le ha suprimido el codón de terminación de la traducción y se ha fusionado en 3' con la secuencia codificante de una proteína heteróloga, de forma que ambas secuencias codificantes están bajo el control transcripcional del mismo promotor constitutivo plastidial.

16. Vector según la reivindicación 15, que comprende adicionalmente una secuencia de reconocimiento de una proteinasa entre el fragmento de ácido nucleico codificante representado por SEQ ID Nº:7, y la secuencia codificante de la proteína heteróloga.

17. Vector según la reivindicación 16, en el que la proteinasa es la enteroquinasa.

18. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la secuencia codificante adicional codifica la albúmina sérica humana (HSA).

19. Vector según la reivindicación 18, que es un derivado del plásmido pAF.

20. Vector según la reivindicación 19, que es el plásmido pAFpsbATRXm-EK-HSA.

21. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la secuencia codificante de la proteína heteróloga codifica la cardiotrofina-1 humana (hCT1).

22. Vector según la reivindicación 21, que es un derivado del plásmido pL3.

23. Vector según la reivindicación 22, que es el plásmido pL3psbATRXm-EK-hCT1.

24. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, que comprende la secuencia codificante de una proteína heteróloga adicional unida operativamente a un promotor constitutivo endógeno plastidial y a una secuencia inductora de la traducción, independientes del promotor y la secuencia inductora de la traducción unidos operativamente a un fragmento representado por codón de inicio ATG unido a SEQ ID Nº:7.

25. Vector según la reivindicación 24, que comprende el codón de inicio ATG unido SEQ ID Nº 7 que está unida operativamente al promotor Prrn y a la secuencia del sitio de unión al ribosoma (RBS) de la región líder del gen 10 del bacteriófago T7 (G10L), y una secuencia codificante de una proteína heteróloga, unida operativamente al promotor PpsbA de N. tabacum.

26. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, en el que la secuencia codificante de la proteína heteróloga codifica la albúmina sérica humana (HSA).

27. Vector según la reivindicación 26, que es un derivado del plásmido pAF.

28. Vector según la reivindicación 27 que es el plásmido pAFpsbAHSA::PrrnG10LTRXm.

29. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, en el que la secuencia de la proteína heteróloga codifica cardiotrofina-1 humana (hCT1).

30. Vector según la reivindicación 29, que es un derivado del plásmido pL3.

31. Vector según la reivindicación 30, que es el plásmido pL3PrrnG10LTRXm::psbAhCT1.

32. Un organismo hospedador transformado con un vector plastidial según una cualquiera de las reivindicaciones 7-31.

33. Organismo hospedador según la reivindicación 32, siendo dicho organismo la bacteria E. coli.

34. Organismo hospedador según la reivindicación 33, en el que el vector es el descrito en las reivindicaciones 13 ó 14.

35. Organismo hospedador según la reivindicación 32, que consiste en una planta transgénica, sus semillas o material de propagación, caracterizada por que su genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores según una cualquiera de las reivindicaciones 7-31.

36. Planta transgénica según la reivindicación 35, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 7-14.

37. Planta transgénica según la reivindicación 36, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.

38. Planta transgénica según la reivindicación 35, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23.

39. Planta transgénica según la reivindicación 38, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

40. Planta transgénica según la reivindicación 38, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23.

41. Planta transgénica según la reivindicación 35, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31.

42. Planta transgénica según la reivindicación 41, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.

43. Planta transgénica según la reivindicación 41, cuyo genoma plastidial lleva integrada la secuencia comprendida entre las secuencias de recombinación homologa de los vectores de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31.

44. Planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43, perteneciente a las especies Nicotiana tabacum o Solanum tuberosum.

45. Método de obtención de las plantas transgénicas de las reivindicaciones 35 a 44, que comprende la integración de un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 7-31, por cualquier medio apropiado, en el plastoma de una planta.

46. Método según la reivindicación 45, que comprende las siguientes etapas:

a) bombardeo de hojas cultivadas in vitro con una pistola de genes cargada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 31;

b) obtención de los primeros transformantes regenerados en medio de cultivo suplementado con un antibiótico frente al cual confiera resistencia el vector bombardeado;

c) realización de, al menos, un segundo ciclo de regeneración en medio selectivo con el mismo antibiótico, para obtener plantas homoplásmicas;

d) selección de las plantas homoplásmicas mediante cualquier método de selección de ADN por tamaños.

47. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 45 ó 46, en el que, las hojas proceden de las especies Nicotiana tabacum o Solanum tuberosum y el antibiótico utilizado es espectinomicina.

48. Procedimiento para sobreexpresar la tiorredoxina m plastidial recombinante representada mediante SEQ ID Nº:8, o proteínas heterólogas fusionadas o coexpresadas con la misma, que comprende las siguientes etapas:

a) Obtener un vector de expresión plastidial recombinante que comprende el fragmento de ácido nucleico codificante representado por codón de inicio ATG unido a SEQ ID Nº:7 y, adicionalmente, secuencias de recombinación homologa que permiten dirigir la inserción en el genoma plastidial de los fragmentos comprendidos entre ellas, un promotor constitutivo endógeno plastidial y una secuencia inductora de la traducción;

b) Transformar un organismo hospedador bacteriano o una planta con el vector de la etapa a).

49. Procedimiento según la reivindicación 48, para sobreexpresar tiorredoxina m plastidial recombinante, en el que el vector de la etapa a) es el vector de expresión descrito en las reivindicaciones 8-14.

50. Procedimiento según la reivindicación 49, en el que el hospedador de la etapa b) es la bacteria E. coli descrita en la reivindicación 34.

51. Procedimiento según la reivindicación 49, en el que el hospedador de la etapa b) es la planta transgénica de la reivindicación 37.

52. Producto enzimático recombinante cuya secuencia está representada por SEQ ID Nº:8, obtenido a partir del hospedador de una cualquiera de las reivindicaciones 34 ó 37, caracterizado por que se obtiene en forma soluble y activa y tiene actividad reductora.

53. Procedimiento según la reivindicación 48, para sobreexpresar proteínas heterólogas fusionadas con tiorredoxina m recombinante, en el que:

a) el vector es un vector de fusión en el que al fragmento de ácido nucleico codificante representado por codón de inicio ATG unido SEQ ID Nº: 7, se le ha suprimido el codón de terminación de la traducción y se ha fusionado en 3' con la secuencia codificante de una proteína heteróloga, de forma que ambas secuencias codificantes están bajo el control transcripcional del mismo promotor constitutivo plastidial;

b) el organismo hospedador es una planta transgénica transformada con el vector de la etapa a).

54. Procedimiento según la reivindicación 53, en el que:

a) el vector es el que se describe en las reivindicaciones 15-23;

b) la planta transgénica es la que se describe en las reivindicaciones 38-40.

55. Procedimiento según la reivindicación 54, para sobreexpresar albúmina sérica humana o cardiotrofina-1 humana, en el que la planta transgénica es la que se describe en las reivindicaciones 39 ó 40.

56. Procedimiento según la reivindicación 48, para sobreexpresar proteínas heterólogas coexpresadas con tiorredoxinas plastidiales m, en el que:

a) el vector es el que se describe en las reivindicaciones 24-31;

b) el organismo hospedador es la planta transgénica de las reivindicaciones 41-43.

57. Procedimiento según la reivindicación 56, para sobreexpresar albúmina sérica humana o cardiotrofina-1 humana, en el que la planta transgénica es la que se describe en las reivindicaciones 42 ó 43.

58. Uso de la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 40 ó 43, para la producción de proteína cardiotrofina-1 humana recombinante de bioactividad incrementada en al menos el doble respecto a la proteína cardiotrofina-1 humana expresada sola en cloroplastos.

59. Composición farmacéutica que comprende la proteína recombinante obtenida a partir de la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 40 ó 43, junto con un adyuvante y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

60. Método de producción de proteínas heterólogas biológicamente activas y/o en su conformación nativa, que comprende:

a) cultivar las plantas transgénicas de una cualquiera de las reivindicaciones 41-43 en condiciones apropiadas para su crecimiento;

b) separar las partes verdes de la planta;

c) purificar la proteína heteróloga utilizando técnicas de cromatografía de afinidad, de separación por tamaños con un patrón o de intercambio iónico.

61. Método según la reivindicación 60, en el que la planta transgénica es la de la reivindicación 42, para producir albúmina sérica humana recombinante en forma soluble y conformación nativa.