Termoestabilización de proteínas.

Una composición que comprende:

un polipéptido de cocaína esterasa (CocE); y

el menos un compuesto de termoestabilización

,

en la que

la CocE en presencia del compuesto es más termoestable que la CocE en ausencia del compuesto; y

el uno o más compuestos de termoestabilización se seleccionan de **Fórmula**

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/069659.

Solicitante: THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 535 West 116th Street 412 Low Memorial Library New York, NY 10027 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LANDRY,Donald, WOODS,JAMES H, MACDONALD,JOANNE, STOJANOVIC,MILAN N, SUNAHARA,ROGER K, NARASIMHAN,DIWAHAR, TESMER,JOHN J. G, BRIM,REMY L.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/505 (Pirimidinas; Pirimidinas hidrogenadas, p. ej. trimetoprima)

PDF original: ES-2510551_T3.pdf

 

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Ilustración 1 de Termoestabilización de proteínas.
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Termoestabilización de proteínas.

Fragmento de la descripción:

Termoestabilización de proteínas Campo

La presente solicitud generalmente se refiere a terapéuticas anticocaína.

Antecedentes

El abuso de la cocaína es un problema social y médico intratable y resistente a los remedios con farmacoterapia. La cocaína actúa bloqueando la recaptación de monoaminas, dopamina, nroepinefrina y serotonina, de modo que prolonga y aumenta los efectos de estos neurotransmisores en el sistema nervioso central (Benowitz, 1993). La toxicidad de la cocaína está marcada por convulsiones y por disfunción cardíaca (p. ej., infarto de miocardio, arritmias cardíacas, hipertensión arterial, ictus o aneurisma diseccionante, e incremento de la demanda miocárdica de oxígeno) debido a los efectos sobre los sistemas neurotransmisores y bloqueo de los canales de sodio del miocardio (Bauman y DiDomenico, 22; Wilson y Shelat, 23; Knuepfer, 23). Dado que la capacidad de la cocaína para atravesar fácilmente la barrera hematoencefálica y sus extendidos efectos sobre los sistemas nerviosos central y periférico, la sobredosis puede producir muerte súbita (véase una revisión en Bauman y DiDomenico, 22).

Aunque el mecanismo de acción de la cocaína se conoce bien, esta información todavía no ha dado lugar al desarrollo de un antagonista eficaz de la cocaína que podría usarse en situaciones de abuso y sobredosis. Los rápidos y pleiotrópicos efectos de la cocaína presentan un problema complejo para el tratamiento de la toxicidad aguda de la cocaína (Carroll y Kuhar, 1999). Los dos tipos de terapias disponibles para el tratamiento del abuso de opioides, el antagonismo (p. ej., naltrexona) y la sustitución (p. ej., metadona) no tienen equivalentes en el caso de la cocaína, aunque se están considerando intentos con el último (p. ej., Grabowski et al., 24). Un abordaje es prevenir o reducid que la cocaína llegue a los sitios de acción administrando esterasas endógenas, anticuerpos específicos de la cocaína o un anticuerpo catalítico.

La cocaína de origen natural es hidrolizada en el éster de benzoílo por la butirilcolinesterasa (BChE) sérica en éster metílico de ecgonina no tóxico y ácido benzoico. En el hígado, la caboxilesterasa hCE-2 hidroliza el éster metílico, dando benzoilecgonina y metanol. La semivida de eliminación en sangre varía de ,5 a 1,5 horas (Inaba, 1989). Se han producido algunos intentos de usar la BChE de origen natural o BChE modificada genéticamente para aumentar la degradación de la cocaína (Véase, por ejemplo, Carmona et al., 2; Xie et al., 1999; Sun et al., 22a; Sun et al., 22b; Duysen et al., 22; Gao and Brimijoin S, 24; Gao et al., 25). Otros investigadores han usado un anticuerpo monoclonal, Mab 15A1, como anticuerpo catalítico contra la cocaína (véase, por ejemplo, Landry et al, 1993; Mets et al., 1998), mientras que otros están explorando el uso de vacunas contra la cocaína (véase, por ejemplo, Kosten et al., 22).

Una bacteria, Rhodococcus sp. MB 1, autóctona del suelo que rodea a la planta de coca, ha desarrollado la capacidad para usar cocaína como su única fuente de carbono y de nitrógeno. La bacteria expresa una cocaína esterasa (CocE) que actúa de modo similar a BChE hidrolizando el éster de benzoílo de la cocaína y dando éster metílico de ecgonina y ácido benzoico (FIG. 1) Bresler et al., 2; Turner et al., 22; Larsen et al., 22). El gen para CocE se ha aislado y clobado (Bresler et al., 2), y se ha determinado la estructura cristalina de CocE (Turner et al., 22; Larsen et al., 22).

La enzima purificada (PM ~65 kDa) cataliza la cocaína con mucha eficiencia con una cinética de Michaelis-Menten caí = 7,2 s"1 y Km = 64 nM (Turner et al., 22; Larsen et al., 22), casi tres órdenes de magnitud superior a las esterasas endógenas y, muy probablemente, actuaría lo bastante rápido como para destoxificar a los seres humanos con sobredosis de cocaína (Landry et al., 1993; Mets et al., 1998). Adicionalmente, la esterasa también metaboliza el cocaetileno, un potente metabolito de la cocaína y el alcohol, casi con la misma eficiencia con la que metaboliza la cocaína (kcat = 9,4 s"1 y Km = 16 nM) (Turner et al., 22; Larsen et al., 22).

Un aspecto de la CocE de Rhodococciis que limita su utilidad es su baja termoestabilidad, su t-i/2 a 37° C es de aproximadamente 15 minutos, mientras que su t-i/2 a 4o C es >6 meses (solicitud de patente PCT PCT/US27/15762). La termoestabilidad se modificó genéticamente en CocE, teniendo varias proteínas mutantes una mayor ti/2 a 37° C de hasta ~ 326 min (Id.).

Existe la necesidad de procedimientos u composiciones adicionales para la termoestabilización de CocE. La presente invención aborda dicha necesidad.

Compendio

Los inventores han descubierto que determinados compuestos termoestabilizan la CocE silvestre también termoestabilizan las CocE mutantes que ya eran más termoestables que la CocE silvestre.

Por tanto, la solicitud está dirigida a composiciones que comprenden una cocaína esterasa (CocE) y un compuesto, en el que la CocE en presencia del compuesto es más termoestable que la CocE en ausencia del compuesto; y el uno o más

compuestos termoestabilizantes se seleccionan de:

La solicitud está dirigida adicionalmente a un método ex vivo de termoestabilización de una cocaína esterasa (CocE), comprendiendo el procedimiento combinar un polipéptido de CocE con uno o más compuestos de 1 termoestabilización seleccionados de:

La solicitud también está dirigida al uso de las composiciones anteriores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección inducida por cocaína.

La solicitud está dirigida adicionalmente a las composiciones anteriores para el uso en el tratamiento de una afección inducida por cocaína.

También se ha descubierto que el mutante de CocE L169K/G173Q tiene un grado inesperadamente alto de 2 termoestabilidad. Véase el Ejemplo 5.

Por tanto, la solicitud dirigida adicionalmente a un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de CocE que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con el

polipéptido de la SEC ID N° 1, en el que el polipéptido de CocE codificado tiene (a) las sustituciones L169K y G173Q, y (b) la actividad esterasa con mayor termoestabilidad a 37°C en comparación con la CocE silvestre.

La solicitud también dirigida al polipéptido de CocE que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con el polipéptido de la SEC ID N° 1, en el que el polipéptido de CocE codificado tiene las sustituciones L169K y G173Q, y la actividad esterasa con mayor termoestabilidad a 37°C en comparación con la CocE silvestre. También se proporcionan composiciones que comprenden el polipéptido en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra el metabolismo de la cocaína catalizada por la cocaína esterasa de Rhodococcus (CocE).

La FIG. 2 son gráficos de la desnaturalización de la cocaína con el tiempo en presencia y ausencia de CocE.

La FIG. 3 muestra el metabolismo del acetato de 4-nitrofenilo (4NPA) catalizado por la CocE y los gráficos de la desnaturalización de 4NPA con el tiempo en presencia y ausencia de CocE

La FIG. 4 es una fotografía de un gel no desnaturalizante que muestra la agregación de CocE tras 1 hora de incubación en varias condiciones y en presencia o ausencia de sustratos o productos.

La FIG. 5 es un gráfico de un análisis espectrofotométrico de la estabilización de la cocaína durante la escisión de 4NPA en presencia de varias concentraciones de cocaína.

La FIG. 6 son gráficos que muestran un análisis espectrofotométrico cinético de la estabilización... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una composición que comprende:

un polipéptido de cocaína esterasa (CocE); y el menos un compuesto de termoestabilización, en la que

la CocE en presencia del compuesto es más termoestable que la CocE en ausencia del compuesto; y el uno o más compuestos de termoestabilización se seleccionan de

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la CocE comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 1;

(ii) una secuencia de aminoácidos al menos un 9% idéntica a la SEC ID N° 1, que tiene actividad esterasa; o

(iii) una secuencia de aminoácidos al menos un 9% idéntica a la SEC ID N° 1, con una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en L163V, V225I, 1218L, A31D, A149S, S159A, S265A, S56G, W22A, S14A, F189L, A193D, T254R, N42V, V262L, L58G, Y152H, V16A, T172R, Y532F, T74S, W285T, L146P, D533S, A194R, G173Q, C477T, K531A, R41I, L119A, K46A, F84Y, T172R/G173Q, L169K, F189A, N197K, R182K, F189K, V19K, Q191K, A194K, y L169K/G173, o una combinación de los mismos, y que tienen actividad esterasa.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que la CocE tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 1 con una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: T172R, S159A, N197K, L169K, F189K, G173Q y T172R/G173Q.

4. La composición de la reivindicación 2, en la que la CocE tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 1 con la sustitución L169K/G173Q.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que la CocE es una CocE pegilada.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la que el al menos un compuesto de termoestabilización se selecciona de:

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en la que el al menos un compuesto de es:

r

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que además comprende un vehículo farmacéuticamente activo.

9. Un método ex vivo de termoestabilización de una cocaína esterasa (CocE), comprendiendo el procedimiento combinar un polipéptido de CocE con uno o más compuestos de termoestabilización seleccionados de:

1. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el polipéptido de CocE comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 1;

(ii) una secuencia de aminoácidos al menos un 9% idéntica a la SEC ID N° 1, que tiene actividad esterasa; o

(iii) una secuencia de aminoácidos al menos un 9% idéntica a la SEC ID N° 1, con una o más sustituciones

seleccionadas del grupo que consiste en L163V, V225I, 1218L, A31D, A149S, S159A, S265A, S56G, W22A, S14A, F189L, A193D, T254R, N42V, V262L, L58G, Y152H, V16A, T172R, Y532F, T74S, W285T, L146P, D533S, A194R, G173Q, C477T, K531A, R41I, L119A, K46A, F84Y, T172R/G173Q, L169K, F189A, N197K, R182K, F189K, V19K, Q191K, A194K, y L169K/G173Q, o una combinación de los mismos, y que tienen 2 actividad esterasa.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 1, en el que la combinación del polipéptido de CocE con uno o más compuestos de termoestabilización se produce in vitro, durante la purificación de CocE, durante el almacenamiento de CocE, o una combinación de los mismos.

12. Una composición que comprende:

(i) un polipéptido de la cocaína esterasa (CocE) aislada, comprendiendo el polipéptido de CocE

(a) una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 1, a excepción de las sustituciones L169Ky G173Q; o

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85% con la SEC ID N° 1, en la que el polipéptido de CocE codificado tiene sustituciones L169K y G173Q y actividad esterasa con una termoestabilidad incrementada a 37°C en comparación con la CocE silvestre; o

(ii) un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de (i); y

(iii) opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 o 12, para el uso en el tratamiento de una afección inducida por cocaína seleccionada del grupo que consiste en sobredosis de cocaína, toxicidad por cocaína, adicción a la cocaína o dependencia de la cocaína.

14. Uso de una composición para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección inducida por

cocaína seleccionada del grupo que consiste en sobredosis de cocaína, toxicidad por cocaína, adicción a la cocaína o dependencia de la cocaína, seleccionada la composición de:

(i) una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; o

(ii) una composición de acuerdo con la reivindicación 12.

15. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en la que la composición se

formula para administración intravenosa o administración mediante minibomba de infusión.