SISTEMAS Y MÉTODOS PARA DETERMINAR LOS COEFICIENTES DE INTERFERENCIA EN LA PCR Y OTROS CONJUNTOS DE DATOS.

Sistemas y métodos para determinar los coeficientes de interferencia en la PCR y otros conjuntos de datos Antecedentes de la invención La presente invención está relacionada en general con los sistemas y métodos para procesar datos que representan curvas de tipo sigmoide o de crecimiento como las curvas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y más concretamente con los sistemas y métodos para determinar las características de interferencia de los sistemas de detección de la PCR. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método in vitro para sintetizar de forma enzimática o amplificar secuencias de ácidos nucleicos definidas. La reacción normalmente utiliza dos cebadores oligonucleótidos que hibridan sobre cadenas opuestas y que flanquean una secuencia de DNA molde o diana que se debe amplificar. La elongación de los cebadores está catalizada por una polimerasa de DNA termoestable. Una serie repetitiva de ciclos que involucran la desnaturalización del molde, la hibridación de cebadores y la extensión de los cebadores hibridados por la polimerasa resulta en una acumulación exponencial de un fragmento específico de DNA. Normalmente se utilizan las sondas fluorescentes en el proceso para facilitar la detección y la cuantificación del proceso de amplificación. En la Fig. 1a se muestra un conjunto de curvas típicas de PCR a tiempo real, en las que los valores de intensidad de la fluorescencia se representan frente al número de ciclos de un proceso de PCR típico. En este caso, la formación de los productos de PCR se monitoriza en cada ciclo del proceso de PCR. La amplificación normalmente se mide en termocicladores que incluyen componentes y dispositivos para medir las señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación. Un ejemplo de tal termociclador es el LightCycler de Roche Diagnostics (Nº Cat. 20110468). Los productos de amplificación, por ejemplo, se detectan mediante sondas de hibridación con un marcaje fluorescente que emiten señales de fluorescencia cuando están unidas al ácido nucleico diana o en ciertos casos también mediante colorantes fluorescentes que se unen al DNA de doble cadena. Como puede observarse en la Fig. 1a, las curvas de PCR incluyen una región de línea basal 5 y una región meseta 6. La región entre la región de línea basal 5 y la región meseta 6 es normalmente denominada la región de crecimiento. Los sistemas de detección de PCR típicos para analizar las emisiones de radiación a partir de los experimentos de PCR incluyen dos o más filtros que pueden utilizarse cada uno de ellos para aislar un rango de longitudes de onda para su posterior análisis. Por ejemplo, cada filtro óptico normalmente permite el paso de sustancialmente toda la radiación dentro de un rango definido de longitudes de onda. Sin embargo, las sondas o marcadores normalmente emiten con bandas de longitud de onda que se solapan parcialmente y la banda de paso del filtro normalmente incluye una región de este solapamiento, de forma que cada canal de detección normalmente recibirá señal emitida por otras sondas. Estas señales de interferencia tienden a afectar la señal real de interés. De acuerdo con esto, es deseable realizar una corrección de estas señales de interferencia en cada canal de detección. Un modo habitual de realizar esto es determinar los coeficientes de interferencia cuantitativos que pueden utilizarse para corregir las señales de interferencia de cada canal de detección. En las metodologías de interferencia actuales, como las que se ejemplifican en la patente US-A-2004 0259260, los coeficientes de interferencia normalmente se calculan utilizando la proporción entre los valores meseta promedios de una señal basal y una de interferencia; los métodos convencionales se basan exclusivamente en la región meseta, que contiene menos del 10% de los datos. Además, durante la PCR, la señal de región meseta se genera cuando reacción química está en un estado inestable. Por este motivo, normalmente se utiliza un umbral de la señal de línea basal para la identificación de la diana. Por lo tanto, los métodos convencionales utilizan una señal con ruido para determinar los coeficientes de interferencia con información limitada que no incluye datos de la señal real de la región de adquisición sobre la curva. Además, también se ha descubierto que las presunciones incorrectas utilizadas en los modelos convencionales de interferencia inducen errores en función de la curva de adquisición de datos. Así, los métodos convencionales de calcular coeficientes de interferencia pueden ser satisfactorios siempre que (1) exista una meseta, (2) esta meseta sea plana y (3) el ruido en la meseta sea mínimo. Sin embargo, existen muchos conjuntos de datos en los que no se dan estas condiciones. Por lo tanto es deseable proporcionar sistemas y métodos para determinar los coeficientes de interferencia en curvas como las curvas de tipo sigmoide o de crecimiento, y las de curvas PCR en particular, que solucionen los problemas anteriores y otros. Breve resumen de la invención La presente invención proporciona sistemas y métodos para determinar los coeficientes de interferencia en curvas, como las curvas de tipo sigmoide o de crecimiento, y las curvas de PCR en particular. La presente invención también proporciona sistemas y métodos para aplicar los coeficientes de interferencia para obtener conjuntos de datos corregidos para la interferencia utilizando un modelo de sustracción lineal. 2 E08773727 27-10-2011   E08773727 27-10-2011 De acuerdo con varias realizaciones, los coeficientes de la señal de interferencia se determinan minimizando la suma de los cuadrados de la diferencia entre una señal base (veces de ganancia más un término lineal opcional) y una señal de interferencia. Se ha demostrado que esta técnica es superior a las técnicas convencionales que utilizan una proporción de los valores promedio de meseta de una señal base y una señal de interferencia. Adicionalmente, esta técnica analiza los datos a lo largo del rango completo de adquisición de la señal para determinar los coeficientes de interferencia. Por ejemplo, pueden utilizarse todos los datos a lo largo del rango de adquisición o porciones de datos a lo largo del rango completo de adquisición. El análisis a lo largo de todos los datos de la curva señal proporciona una corrección de la interferencia más robusta a los largo de todo el rango de adquisición de datos. Además, los métodos convencionales asumen que las señales medidas a partir de todas las fuentes siguen un modelo aditivo lineal y que todas las señales se analizan entre los detectores, y esto no es cierto, por lo que resulta tanto en sobrecorrecciones e infracorrecciones de la señal resultante. Por el contrario, las técnicas de la presente invención utilizan un modelo de sustracción lineal que supera este problema y que representa un modelo más ajustado a los sistemas de detección reales. Estas nuevas técnicas hallarán su mayor utilidad en los ejemplos en los que los coeficientes de interferencia están en el rango del 2% o superior. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar los coeficientes de interferencia para un sistema de detección óptica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos dos elementos ópticos, en los que cada elemento óptico puede utilizarse para aislar un rango específico de longitudes de ondas electromagnéticas diferente. El método incluye la adquisición, para cada elemento óptico, de un conjunto de datos de PCR a lo largo de un rango de adquisición de un proceso de crecimiento de PCR, y simultáneamente la adquisición, para cada uno de los demás elementos ópticos, de un conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. El método también incluye la determinación de los coeficientes de interferencia utilizando los conjuntos de datos de PCR y de interferencia. En ciertos aspectos, el rango de adquisición incluye una región de línea basal, una región de crecimiento y una región meseta. La determinación de los coeficientes de interferencia incluye minimizar la suma de los cuadrados o los valores absolutos de las diferencias entre cada conjunto de datos de PCR y conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. En ciertos aspectos, los coeficientes de interferencia se aplican a un conjunto de datos de PCR para obtener un conjunto de datos de PCR corregidos para la interferencia. En ciertos aspectos, se utiliza un modelo de sustracción lineal para aplicar los coeficientes de interferencia. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un medio legible mediante un computador que incluye o almacena código que controla un procesador para determinar los coeficientes de interferencia de un sistema de detección... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar los coeficientes de interferencia de un sistema de detección óptica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos dos elementos ópticos, en el que cada elemento óptico puede utilizarse para aislar un rango diferente de longitud de onda electromagnética específico, y este método comprende: -la adquisición, para cada elemento óptico, de un conjunto de datos de PCR a lo largo de un rango de adquisición de un proceso de crecimiento de PCR; -simultáneamente la adquisición, para cada uno de los demás elementos ópticos, de un conjunto de datos de interferencia producido por un solapamiento de al menos los espectros de dos colorantes en al menos dos rangos de filtro, cuyo conjunto de datos de interferencia se ha adquirido a lo largo del rango de adquisición; y -la determinación de los coeficientes de interferencia utilizando los conjuntos de datos de PCR y de interferencia a lo largo del rango de adquisición, en la que la determinación de los coeficientes de interferencia incluye minimizar la suma de los cuadrados o los valores absolutos de las diferencias entre el conjunto de datos de PCR y el conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el rango de adquisición de datos representa una pluralidad de ciclos de PCR, y en el que la determinación de coeficientes de interferencia incluye minimizar la suma de los cuadrados entre cada conjunto de datos de PCR y cada conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que minimizar la suma de los cuadrados incluye utilizar una ecuación de forma: min [i (SeñalXTi q*Señali) 2 ] en la que i es el número de ciclos de PCR, en el que Señali es el conjunto de datos de PCR para un elemento óptico, en el que SeñalXTi es el conjunto de datos de interferencia para un elemento óptico, y en el que q es un factor multiplicador de ganancia. 4. El método de la reivindicación1 o 2, en el que minimizar la suma de los cuadrados incluye utilizar una ecuación de forma: min [i [(SeñalXT1i (r+s*i+q1*Señali)) 2 + (SeñalXT2i (r+s*i+q2*Señali)) 2 + (SeñalXT3i (r+s*i+q3*Señali)) 2 ] ] en la que i es el número de ciclos de PCR, Señali es el conjunto de datos de PCR de un elemento óptico, XTSeñali es el conjunto de datos de interferencia de un elemento óptico, r es una distancia (del inglés offset) común, s es una pendiente común y en el que q1, q2 y q3 son factores multiplicadores de ganancia. 5. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que minimizar la suma de los cuadrados incluye utilizar una ecuación de forma: min [i (SeñalXTi (r+s*i + q*Señali)) 2 ] en la que i es el número de ciclos de PCR, Señali es el conjunto de datos de PCR de un elemento óptico, XTSeñali es el conjunto de datos de interferencia de un elemento óptico, r es una distancia (del inglés offset), s es una pendiente y en el que q es un factor multiplicador de ganancia. 6. El método de la reivindicación 1, que también incluye: -determinar una línea basal para cada conjunto de datos de PCR y cada conjunto de datos de interferencia; y -previamente a la determinación de los coeficientes de interferencia, sustraer la respectiva línea basal de cada conjunto de datos. 7. El método de la reivindicación 1, que también incluye: -aplicar los coeficientes de interferencia determinados al conjunto de datos de PCR utilizando un modelo de sustracción lineal para obtener un conjunto de datos corregidos para la interferencia. 8. El método de la reivindicación 7, en el que el modelo de sustracción lineal incluye una ecuación de forma: E08773727 27-10-2011   en la que i es la señal medida en el canal (i) y iC es la señal corregida para la interferencia del canal (i), y en la que los coeficientes aij indican los coeficientes de interferencia del canal (j) en el canal (i). 9. El método de la reivindicación 7, en el que el modelo de sustracción lineal incluye una ecuación de forma: en la que i es la señal medida en el canal (i) y iC es la señal corregida para la interferencia del canal (i), y en la que los coeficientes aij indican los coeficientes de interferencia del canal (j) en el canal (i), y r y s son una ganancia y un término lineal, respectivamente, que son comunes para todos los canales (i). 10. El método de la reivindicación 7, en el que el modelo de sustracción lineal incluye una ecuación de forma: en la que i es la señal medida en el canal (i) y iC es la señal corregida para la interferencia del canal (i), y los coeficientes aij indican los coeficientes de interferencia del canal (j) en el canal (i), y en la que ri y si son una ganancia y un término lineal, respectivamente, que son diferentes para cada canal (i).. 11. Un medio legible por computador que incluye un código para controlar un procesador para determinar los coeficientes de interferencia de un sistema de detección óptica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos dos elementos ópticos, en los que cada elemento óptico puede utilizarse para aislar un rango específico de longitudes de onda electromagnética diferentes, cuyo código incluye instrucciones para: -recibir, para cada elemento óptico, un conjunto de datos de PCR adquirido a lo largo de un rango de adquisición de un proceso de crecimiento de PCR, cuyo rango de adquisición incluye una región de línea basal, una región de crecimiento y una región meseta; -simultáneamente recibir, para cada uno de los demás elementos ópticos, un conjunto de datos de interferencia para cada filtro producido por el solapamiento de al menos dos espectros de colorantes en al menos dos rangos de filtro, y dicho conjunto de datos de interferencia se adquiere a lo largo del rango de adquisición; y -determinar los coeficientes de interferencia utilizando los conjuntos de datos de PCR y de interferencia a lo largo del rango de adquisición, en el que determinar los coeficientes de interferencia incluye minimizar la suma de los cuadrados o los valores absolutos de las diferencias entre el conjunto de datos de PCR y el conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. 12. Un sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cinética que comprende: -un módulo de detección óptica con al menos dos elementos ópticos, en el que cada elemento óptico puede utilizarse para aislar un rango diferente de longitudes de ondas electromagnéticas específico, y cuyo módulo de detección óptica está adaptado para: -adquirir, para cada elemento óptico, un conjunto de datos de PCR a lo largo de un rango de adquisición de un proceso de crecimiento de PCR, en el que el rango de adquisición incluye una región de línea basal, una región de crecimiento y una región meseta; y -simultáneamente adquirir, para cada uno de los demás elementos ópticos, un conjunto de datos de interferencia producidos por el solapamiento de menos dos espectros de colorante en al menos dos rangos de filtro, cuyo conjunto de datos de interferencia se adquiere a lo largo del rango de adquisición; y -un módulo de inteligencia adaptado para procesar el conjuntos de datos de PCR adquiridos y los conjuntos de datos de interferencia para determinar los coeficientes de interferencia utilizando los conjuntos de datos de PCR y de interferencia a lo largo del rango de adquisición, y en el que el módulo de inteligencia determina los coeficientes de interferencia minimizando la suma de los cuadrados o los valores absolutos de las diferencias entre cada conjunto de datos de PCR y conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. 13. Un sistema de análisis de fusión de ácidos nucleicos, que comprende: -un módulo de detección óptica con al menos dos elementos ópticos, en el que cada elemento óptico puede utilizarse para aislar un rango diferente de longitudes de ondas electromagnéticas específico, y cuyo módulo de detección óptica está adaptado para: 16 E08773727 27-10-2011   -adquirir, para cada elemento óptico, un conjunto de datos de fusión a lo largo de un rango de adquisición de temperatura; y simultáneamente adquirir, para cada uno de los demás elementos ópticos, un conjunto de datos de interferencia producidos por el solapamiento de menos dos espectros de colorante en al menos dos rangos de filtro, cuyo conjunto de datos de interferencia se adquiere a lo largo del rango de adquisición de temperatura; y -determinar los coeficientes de interferencia minimizando la suma de los cuadrados entre cada conjunto de datos de fusión y cada conjunto de datos de interferencia a lo largo del rango de adquisición. 17 E08773727 27-10-2011   Figura 1A Figura 1B Región de la línea basal 5 Recibe los datos de PCR en un canal de detección Recibe de forma simultánea los datos de interferencia de otros canales de detección en el sistema Determinar los coeficientes de interferencia; procesar los conjuntos de datos de PCR e interferencia Aplicar los coeficientes de interferencia al conjunto de datos de PCR para obtener conjuntos de datos corregidos para la interferencia Almacenar y/o mostrar los datos 18 Meseta 6 E08773727 27-10-2011   Figura 2 Figura 2A Figura 2B 19 E08773727 27-10-2011   Figura 4 (parte 1) E08773727 27-10-2011   Figura 4 (parte 2) 21 E08773727 27-10-2011   Figura 5 Figura 6 22 E08773727 27-10-2011   Figura 7 Figura 8 23 E08773727 27-10-2011   Figura 9 Figura 10 24 E08773727 27-10-2011   Figura 11 Figura 12 E08773727 27-10-2011   Figura 13 Figura 14 26 HIV en el canal FAM E08773727 27-10-2011   Figura 15 Figura 16 Figura 17 27 E08773727 27-10-2011   Figura 18 Dispositivo termociclador Figura 3 Medio de almacenamiento externo Medio de almacenamiento dispositivo de visualización Módulo de análisis de PCR cinética Intensidad Conjunto de datos de PCR (transferencia mediante conexión de red o conexión directa) Longitud de onda 28 Dispositivo de procesamiento Medio de almacenamiento Dispositivo de entrada (ratón, teclado, interfaz, puerto) Módulo de inteligencia Sistema informático Medio de Almacenamiento externo Filtro 1 Filtro 2 E08773727 27-10-2011