Molécula de ARN recombinante que comprende un emplazamiento de enlace específico de una polimerasa de ARN dirigida por ARN de un virus de la enfermedad de Newcastle y las señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV,

enlazada operativamente a una secuencia de ARN heteróloga, en el que dicho emplazamiento de enlace incluye el emplazamiento de enlace de la polimerasa, y las señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV se encuentran contenidas en las regiones de flanqueo no codificadas 3'' y 5'' de un genoma del ARN vírico de la enfermedad de Newcastle, y en la que las regiones de flanqueo no codificadas 3'' y 5'' tienen una secuencia de sentido vírico de:

Sistemas de expresión de ARN del virus recombinante de la enfermedad de Newcastle y las correspondientes vacunas.

1. Introducción

La presente invención se refiere a plantillas del ARN del virus de la enfermedad de Newcastle, que pueden utilizarse para expresar productos de genes heterólogos, en sistemas celulares hospedadores apropiados, y/o para construir virus recombinantes que expresen, empaqueten y/o presenten el producto del gen heterólogo. Los productos de expresión y los virus quiméricos pueden utilizarse ventajosamente en la formulación de vacunas. La presente invención también hace referencia a virus recombinantes genéticamente modificados de la enfermedad de Newcastle, que contienen modificaciones y/o mutaciones que hacen que los virus recombinantes sean adecuados para su utilización en formulaciones de vacunas, como una mayor inmunogenicidad o un fenotipo mejorado.

La presente invención se refiere a virus recombinantes de la enfermedad de Newcastle que inducen interferón y procesos relacionados. La presente invención se refiere al uso de los virus recombinantes de la enfermedad de Newcastle y los vectores víricos contra una amplia gama de patógenos y/o antígenos, incluyendo antígenos específicos tumorales. La invención se demostrará mediante ejemplos en los que se construyeron plantillas del ARN del virus recombinante de la enfermedad de Newcastle que contienen secuencias de codificación de genes heterólogos en la polaridad negativa. La invención se refiere asimismo a la construcción de plantillas del ARN del virus recombinante de la enfermedad de Newcastle que contienen secuencias de codificación de genes heterólogos en la polaridad positiva. Dichas secuencias de genes heterólogos incluyen secuencias derivadas de un virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

2. Antecedentes de la invención

Se han diseñado mediante ingeniería genética diversos virus ADN para dirigir la expresión de proteínas heterólogas en sistemas celulares hospedadores (por ejemplo, el virus de la vacuna, el baculovirus, etc.). Recientemente se han logrado avances similares con los virus de ARN de cadenas positivas (por ejemplo, poliovirus). Los productos de expresión de estos constructos, es decir, el producto genético heterólogo del virus quimérico que expresa el producto genético heterólogo se consideran como potencialmente útiles para la formulación de vacunas (tanto vacunas de subunidad como de virus completo). Uno de los inconvenientes del uso de virus, como el de la vacuna, para reconstruir virus recombinantes o quimérico es para su utilización en vacunas es la falta de variación de sus principales epítopos. Esta falta de variabilidad de la cadena vírica plantea limitaciones estrictas a la utilización repetida de vacunas quiméricoes, pues las múltiples vacunaciones generan una resistencia a la cepa en el organismo hospedador, de forma que el virus inoculado no puede afectar al organismo hospedador. Por lo tanto, la inoculación de un individuo resistente con una vacuna quimérico no inducirá la estimulación inmune.

Por el contrario, el virus de ARN de cadena negativa sería un candidato atractivo para la fabricación de virus quiméricos para su utilización en vacunas. Los virus de ARN de cadena negativa como, por ejemplo, el de la gripe, resultan deseables debido a que su amplia variabilidad genética permite la fabricación de un vasto repertorio de formulaciones de vacunas que estimulan la inmunidad sin el riesgo de desarrollar una tolerancia. Recientemente, la construcción de partículas ARN de cadena negativa quiméricoes o recombinantes infecciosas se ha conseguido con el virus de la gripe (Patente estadounidense Nº 5.166.057, Palese et al.).

2.1 El virus de la enfermedad de Newcastle

Las familias de virus que contienen ARN de cadena única del genoma de sentido negativo se clasifican en grupos que contienen genomas no segmentados (Paramixoviridae, Rabdoviridae) o aquellos que contienen genomas segmentados (Ortomixoviridae, Bunyaviridae o Arenaviridae) La familia del Paramixoviridae, que se describe en mayor detalle a continuación, y que se utiliza en los ejemplos del presente documento, contiene los virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) el virus paragripal, el virus Sendai, el virus del simio Nº 5 y el virus de la parotiditis.

El virus de la enfermedad de Newcastle es un virus con cubierta que contiene un genoma ARN lineal, de cadena única, no segmentado, negativo. El ARN genómico contiene genes del orden de 3'-NP-P-M-F-HN-L, descritos en mayor detalle a continuación. El ARN genómico también contiene una secuencia de inicio en el extremo 3'.

Los elementos estructurales del virión incluyen la cubierta del virus, que es una doble capa de lípidos derivada de la membrana del plasma celular. La glicoproteína, es decir, la hemaglutininaneuraminidasa (HN), sobresale de la cubierta permitiendo que el virus contenga actividades de hemaglutinina y neuraminidasa. La glicoproteína de la fusión (F), que también interactúa con la membrana viral, se produce en primer lugar como un precursor inactivo, y posteriormente es partida post-translacionalmente, para obtener dos polipéptidos enlazados al bisulfito. La proteína activa F participa en la penetración del NDV en las células hospedadoras facilitando la fusión de la cubierta viral con la membrana del plasma de la célula hospedadora. La proteína matriz (M), participa en el ensamblaje del virus, e interactúa con la membrana viral y con las proteínas del nucleocápside.

La principal subunidad proteínica del nucleocápside es la proteína nucleocapsídica (NP) que confiere la simetría helicoidal de la cápside. En asociación con el nucleocápside se encuentran las proteínas P y L. Se cree que la fosfoproteína (P), que se encuentra sometida a fosforilación, desempeña un papel regulador en la transcripción, pudiendo también participar en la metilación, fosforilación y poliadenilación. El gen L, que codifica una polimerasa de ARN dependiente del ARN, es necesario para la síntesis del ARN vírico, junto con la proteína P. La proteína L, que asume casi la mitad de la capacidad de codificación del genoma vírico es la mayor de las proteínas víricas, y desempeña un importante papel, tanto en la transcripción como en la replicación.

La replicación de los virus de ARN de cadena negativa, incluyendo el NDV, se complica por la ausencia de la maquinaria celular necesaria para la replicación del ARN. Adicionalmente, el genoma de la cadena negativa no puede traducirse directamente en proteínas, pero en primer lugar debe transcribirse en una copia de cadena positiva (mARN). Por lo tanto, al introducirse en una célula hospedadora, el ARN genómico no puede por sí sólo sintetizar la polimerasa ARN requerida dependiente del ARN. Las proteínas L, P y NP deben introducirse en la célula junto con el genoma al producirse la infección.

Una de las hipótesis es que la mayor parte o la totalidad de las proteínas víricas que transcriben el mARN del NDV efectúan también su replicación. El mecanismo que regula los usos alternativos (es decir, transcripción o replicación) del mismo complemento de proteínas no ha sido claramente identificado, pero parece implicar la abundancia de formas libres de uno o más de las proteínas nucleocapsídicas, concretamente la NP. Directamente después de la penetración del virus, la transcripción es iniciada por la proteína L utilizando como plantilla el ARN de cadena negativa de la nucleocápside. La síntesis del ARN vírico se regula de forma que produzca MARNs monocistrónicos durante la transcripción.

Tras la transcripción, la replicación del genoma vírico es el segundo evento esencial en la infección mediante virus de ARN de cadena negativa. Al igual que sucede con el otros virus de ARN de cadena negativa, la replicación del genoma vírico en el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) está mediada por las proteínas específicas del virus. Los primeros productos de la síntesis replicativa del ARN son copias complementarias (es decir, con polaridad positiva) del genoma del ARN del NDV (cARN). Estas copias de cadena positiva (antigenomas) difieren de las transcripciones de mARN de cadena positiva en la estructura de sus terminales. A diferencia de las transcripciones de mARN, los cARNs antigenómicos no están limitados y metilados en el terminal 5', y no están truncados y poliadenilatado en el terminal 3'. Los cARNs son coterminales con sus plantillas de cadena negativa y contienen toda la información genética en cada segmento de ARN genómico en la forma complementaria. Los cARNs sirven como plantilla para la...

1. Molécula de ARN recombinante que comprende un emplazamiento de enlace específico de una polimerasa de ARN dirigida por ARN de un virus de la enfermedad de Newcastle y las señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV, enlazada operativamente a una secuencia de ARN heteróloga, en el que dicho emplazamiento de enlace incluye el emplazamiento de enlace de la polimerasa, y las señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV se encuentran contenidas en las regiones de flanqueo no codificadas 3' y 5' de un genoma del ARN vírico de la enfermedad de Newcastle, y en la que las regiones de flanqueo no codificadas 3' y 5' tienen una secuencia de sentido vírico de:

2. Molécula de ARN recombinante

a) que incluye un emplazamiento de enlace para una polimerasa de ARN dirigida por ARN de un virus de la enfermedad de Newcastle y las señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV, enlazada operativamente a un gen vírico de la enfermedad de Newcastle; y

b) que contiene una mutación que se encuentra en la molécula de ARN y que comprende un emplazamiento de enlace para una polimerasa de ARN de un NDV y las señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV, y que tiene como resultado un fenotipo atenuado o una inmunogenicidad reforzada,

en la que dicho emplazamiento de enlace comprende el emplazamiento de enlace de la polimerasa, estando dichas señales requeridas para replicación y transcripción con mediación de NDV y dicha mutación, contenidas en la región de flanqueo no codificada 3' y 5' de un genoma de ARN vírico de la enfermedad de Newcastle, y

en la región de flanqueo no codificada 3' y 5' posee una secuencia de sentido vírico de:

3. Molécula de ARN recombinante de la reivindicación 1, en la que el ARN heterólogo codifica un antígeno vírico.

4. Molécula de ARN recombinante de la reivindicación 3, en la que el antígeno vírico se obtiene del virus de inmunodeficiencia humana, del virus de la enfermedad de Newcastle, de la gripe, del virus sincitial respiratorio, del virus de la enfermedad de Marek, del virus de la bursitis infecciosa, del virus de la bronquitis infecciosa, del virus de la bursitis infecciosa, del virus de la anemia del pollo, del virus de la laringotraqueitis infecciosa, del virus de la leucosis aviar, del virus de la reticuloendoteliosis, del virus de la gripe aviar, del virus de la rabia, del virus de la leucemia felina, del virus del moquillo, del virus de la estomatitis vesicular, del virus de la peste bovina, o del virus de la peste porcina.

5. Célula recombinante que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una molécula recombinante NDV de la reivindicación 1 y proteínas P y L de la polimerasa de ARN de NDV.

6. Virus quimérico que comprende un virus de ARN de cadena negativa que contiene la molécula de ARN recombinante de la reivindicación 1.

7. Virus quimérico de la reivindicación 6, en el que el ARN heterólogo se obtiene a partir de un antígeno viral.

8. Virus quimérico de la reivindicación 7, en el que el antígeno vírico se obtiene del virus de inmunodeficiencia humana, del virus de la enfermedad de Newcastle, del virus de la gripe, del virus sincitial respiratorio, del virus de la enfermedad de Marek, del virus de la bursitis infecciosa, del virus de la bronquitis infecciosa, del virus de la bursitis infecciosa, del virus de la anemia del pollo, del virus de la laringotraqueitis infecciosa, del virus de la leucosis aviar, del virus de la reticuloendoteliosis, del virus de la gripe aviar, del virus de la rabia, del virus de la leucemia felina, del virus de la estomatitis vesicular, del virus de la peste bovina, o del virus de la peste porcina.

9. Virus quimérico de la reivindicación 6, en el que el ARN heterólogo está contenido en el gen HN del virus de la enfermedad de Newcastle.

10. Virus quimérico que comprende un virus de ARN de cadena negativa que contiene la molécula de ARN recombinante de la reivindicación 2.

11. Método para producir un virus quimérico de ARN de cadena negativa, que incluye la transfección de una célula hospedadora con secuencias de nucleótidos que codifican el ARN recombinante de las reivindicaciones 1 o 2, y las funciones víricas necesarias para replicación y transcripción, y recuperación del virus quimérico a partir del cultivo.

12. Formulación para vacuna que comprende un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado genéticamente modificado, que comprende la molécula de ARN recombinante de la reivindicación 2, y un excipiente fisiológicamente aceptable.

13. Formulación para vacuna de la reivindicación 12, en la que la modificación se obtiene de una mutación natural.

14. Formulación para vacuna que comprende un virus quimérico de la enfermedad de Newcastle modificado genéticamente, cuyo genoma codifica un epítopo heterólogo que comprende la molécula de ARN recombinante de la reivindicación 1, y un excipiente farmacológicamente aceptable.

15. Formulación para vacuna de la reivindicación 14, en la que el epítopo heterólgo es un antígeno vírico.

16. Formulación para vacuna de la reivindicación 15, en el que el antígeno vírico se obtiene del virus de inmunodeficiencia humana, del virus de la enfermedad de Newcastle, del virus de la gripe, del virus sincitial respiratorio, del virus de la enfermedad de Marek, del virus de la bursitis infecciosa, del virus de la bronquitis infecciosa, del virus de la bursitis infecciosa, del virus de la anemia del pollo, del virus de la laringotraqueitis infecciosa, del virus de la leucosis aviar, del virus de la reticuloendoteliosis, del virus de la gripe aviar, del virus de la rabia, del virus de la leucemia felina, del virus de la estomatitis vesicular, del virus de la peste bovina, o del virus de la peste porcina.

17. Formulación para vacuna de la reivindicación 14, en la que el epítopo heterólogo es una proteína inmunopotenciadora.

18. Formulación para vacuna de la reivindicación 14, en la que el epítopo heterólogo es un antígeno tumoral.