SISTEMA DE SEGURIDAD.

Un método de producir un marcador de seguridad para marcar objetos y/o personas,

comprendiendo: (A) provisión de una molécula de ácido nucleico con una secuencia de 40-230 nucleótidos, comprendiendo dicha secuencia (i) una primera zona de cebador constando de 15-50 nucleótidos, en la que dicha primera zona del primer cebador sea substancialmente idéntica a un primer cebador y vinculada a la zona del primer cebador, (ii) una zona de marcador que consta de una secuencia predeterminada de ácido nucleico capaz de identificar la fuente del marcador de seguridad; y (iii) una segunda zona de cebador que consta de 15-50 nucleótidos que sea substancialmente el complemento inverso de un segundo cebador y en la que dicha zona del segundo cebador sea capaz de estar ligada por el segundo cebador; y (B) escaneado de la secuencia del ácido nucleico de la zona del primer cebador (o del primer cebador) y la secuencia del ácido nucleico de la zona del segundo cebador (o el segundo cebador) contra una base de datos públicamente disponible para confirmar que las secuencias del ácido nucleico de las zonas del primero y segundo cebador no ocurran en 150 bases la una de la otra en una secuencia de DNA nativo de humanos, perros, gatos, ratones, insectos u organismos procarióticos

El presente invento está relacionado con marcadores de seguridad para marcar objetos y personas, métodos de uso de dichos marcadores, métodos de detección de dichos marcadores y dispositivos de seguridad que contienen dichos marcadores. En particular, los marcadores de seguridad usados comprenden una molécula de ácido nucleico que podrá identificarse exclusivamente a una fuente específica del marcador de seguridad.

Los marcadores de seguridad para la identificación de la propiedad de un artículo ya son conocidos en este campo. Algunos marcadores utilizan una formulación específica de diferentes compuestos químicos para identificar que un objeto es propiedad de una persona determinada o que está localizado en un lugar específico. Tales marcadores químicos se ven, por ejemplo, en la GB 2245583. Tales sistemas tienen sólo un número limitado de compuestos de identificación, dificultando por ello la identificación exclusiva de un gran número de lugares específicos.

Los marcadores de seguridad que comprenden el uso de moléculas de ácido nucleico son también conocidos en este campo, como se puede ver, por ejemplo, en las WO 94/04918, WO 87/06383 y WO 95/02702. Tales marcadores de seguridad pueden identificarse sencillamente por el uso de una sonda apropiada que puede hibridizarse con el ácido nucleico dentro del marcador. El uso de la reacción en cadena de las polimerasas (PCR, Polymerase Chain Reaction) para aislar y multiplicar una muestra de ácido nucleico en un marcador de seguridad es conocido, como se muestra en la WO 90/14441.

WO 95/02702 describe un método para hacer artículos con gotas que llevan ácidos nucleicos vinculadas a ellas.

US 5,451,505 describe un método para etiquetar y rastrear materiales usando ácidos nucleicos como taggants.

US 5,643,728 describe un método para marcar un líquido con una pluralidad de ácido nucleico con partículas.

Una ventaja de usar una molécula de ácido nucleico como marcador de seguridad es que se puede usar una secuencia única de nucleótidos para cada usuario del marcador de seguridad o para cada lugar específico en el que se utilice dicho marcador de seguridad. El uso de oligonucleótidos con secuencias aleatorias de ácido nucleico se revela en la US 5.139.812.

Los inventores se han dado cuenta de que existe un mercado para los marcadores de seguridad mejorados. Tales marcadores de seguridad pueden

utilizarse para etiquetar mercancías o alternativamente podrán usarse en un sistema de seguridad en el que son pulverizados sobre un intruso al activarse el dispositivo pertinente. En el último caso, tales marcadores de seguridad son útiles para demostrar que un intruso estuvo en la escena del crimen.

Cuando tal marcador se utilice específicamente con fines de detección criminal, es importante que la detección del marcador esté lo más libre de error posible para reducir la posibilidad de una falsa condena a terceras partes.

Los inventores se dieron cuenta de que la reacción en cadena de las polimerasas de una hebra de ácido nucleico usando un cebador apropiado, seguido por la secuenciación de dicho cebador, no siempre produce una secuencia

consistente para cualquier marcador de DNA. Por lo tanto, es útil disponer de un respaldo para confirmar la secuencia de cualquier secuencia exclusiva de una zona de marcador del marcador de seguridad. Los inventores han proporcionado, por lo tanto, una segunda zona de cebador en el marcador de seguridad que permite confirmar la secuencia de la zona del marcador facilitando la producción de la hebra complementaria por la PCR y su subsiguiente secuenciación utilizando un segundo cebador.

Por consiguiente, un primer aspecto del invento proporciona el método de producir un marcador de seguridad para marcar objetos y/o personas como se establece en las reivindicaciones.

Los términos “sustancialmente idéntico al primer cebador” o “sustancialmente el complemento inverso de un segundo cebador” se utilizan para significar que hay suficiente homología para permitir al primer o segundo cebador, y a la zona a la que están unidos en el marcador de seguridad, o a una molécula de ácido nucleico complementaria al marcador de seguridad, hibridizarse en condiciones de alto rigor. Tales condiciones se dan preferiblemente bajo condiciones típicas PCR.

Preferentemente, el marcador de seguridad es una molécula de ácido nucleico de hebra única que es más fácil de fabricar como oligonucleótido. Alternativamente, podrán usarse marcadores de doble hebra.

Preferentemente, en uso, el segundo cebador se utiliza para permitir que la molécula de ácido nucleico sea replicada por la PCR, produciendo así una segunda hebra complementaria de ácido nucleico. La hebra complementaria está formada de una zona de cebador que tiene la secuencia correcta para permitir al primer cebador unirse a ella. El primer cebador puede utilizarse, entonces, para multiplicar la hebra complementaria de ácido nucleico.

Preferentemente, la zona del cebador complementario se localiza corriente abajo de la zona del marcador.

Los inventores se han dado cuenta también que donde se haya acoplado un marcador a un objeto o a un intruso, por ejemplo, existe con frecuencia una gran cantidad de fragmentos contaminantes de DNA, por ejemplo, de seres humanos y/o animales de compañía, tales como perros o gatos, que estén alrededor del objeto o intruso.

Por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico del primer cebador y la secuencia de ácido nucleico del segundo cebador se seleccionan de manera que haya una baja probabilidad de que sus respectivas zonas vinculantes del cebador ocurran con 150 bases o 120 o 100 bases una de otra en el DNA nativo. Es decir, que las secuencias que ocurren naturalmente a las que los cebadores usados con el marcador de seguridad pueden emparejarse en condiciones de alto rigor, no ocurren normalmente dentro de 150 bases una de otra en el DNA nativo.

Preferiblemente, la probabilidad es menor del 95%, especialmente menor del 97%, y más preferiblemente menor del 99%.

Por alto rigor queremos decir, por ejemplo, 1.5 mM MgCl2, 53º de temperatura de recocido.

Esto se ha conseguido seleccionando cuidadosamente los cebadores usados contra las bases de datos de secuencias nucleótidas públicamente disponibles. Preferentemente, el DNA nativo es procariótico o eucariótico, especialmente el DNA de seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y/o insectos.

Esto tiene la ventaja de que es posible identificar rápidamente fragmentos de DNA amplificados que contengan la zona del marcador por tamaño. Uno u otro cebador puede emparejarse a un marcador de DNA no seguro, pero para producir un producto PCR se requiere que ambos cebadores se emparejen, pero es probable que éstos produzcan sólo DNA de un tamaño diferente al DNA del marcador de seguridad de DNA, permitiendo así que tales fragmentos sean fácilmente descartados.

Una vez que se haya identificado una muestra que contenga un marcador de seguridad, dicho marcador de seguridad podrá entonces secuenciarse para determinar la secuencia exacta de la zona del marcador.

Preferentemente, los cebadores y las zonas a las cuales se emparejan en el marcador de seguridad, o a una molécula complementaria, son 100% complementarios a su zona vinculante. Esto permite usar unos altos niveles de rigor para probar la presencia del marcador.

En una de sus posibles formas especialmente preferidas, los inventores han identificado ese ácido nucleico del oso perezoso de garganta marrón (Bradypus variegatus). La secuencia especialmente preferida del oso perezoso de garganta marrón es una secuencia de ácido nucleico correspondiente al gene ND1 mitocondrial del oso perezoso.

Por ácido nucleico queremos decir DNA o RNA de hebra sencilla o doble de origen natural o sintético, o derivativos sintéticos del mismo, que podrían estar total o parcialmente formados de bases raras o por bases modificadas.

Las zonas del cebador están dispuestas en el ácido nucleico para permitir a un cebador apropiado de ácido hibridizarse selectivamente a la zona del cebador, permitiendo así al marcador de seguridad que contiene la zona del marcador amplificarse a partir de una muestra.

Preferentemente, la zona del cebador está formada de entre 15 y 50, preferentemente 17-30, especialmente 18 nucleótidos para...

1. Un método de producir un marcador de seguridad para marcar objetos y/o personas, comprendiendo:

(A) provisión de una molécula de ácido nucleico con una secuencia de 40-230 nucleótidos, comprendiendo dicha secuencia

(i) una primera zona de cebador constando de 15-50 nucleótidos, en la que dicha primera zona del primer cebador sea substancialmente idéntica a un primer cebador y vinculada a la zona del primer cebador,

(ii) una zona de marcador que consta de una secuencia predeterminada de ácido nucleico capaz de identificar la fuente del marcador de seguridad; y

(iii) una segunda zona de cebador que consta de 15-50 nucleótidos que sea substancialmente el complemento inverso de un segundo cebador y en la que dicha zona del segundo cebador sea capaz de estar ligada por el segundo cebador; y

(B) escaneado de la secuencia del ácido nucleico de la zona del primer cebador (o del primer cebador) y la secuencia del ácido nucleico de la zona del segundo cebador (o el segundo cebador) contra una base de datos públicamente disponible para confirmar que las secuencias del ácido nucleico de las zonas del primero y segundo cebador no ocurran en 150 bases la una de la otra en una secuencia de DNA nativo de humanos, perros, gatos, ratones, insectos u organismos procarióticos.

2. Un método de producir un marcador de seguridad según la Reivindicación 1, en el que la zona del cebador complementario está aguas debajo de la zona del marcador.

3. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la zona del primer cebador sea diferente de la zona del segundo cebador.

4. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la zona del cebador, o cada una de las zonas del cebador, venga derivada del oso perezoso de garganta marrón (Bradypus variegatus).

5. Un método de producir un marcador de seguridad según la Reivindicación 4, en el que la zona del cebador o cada una de las zonas del cebador venga derivada del gene ND1 mitocondrial.

6. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier

reivindicación precedente, en la que la zona del marcador conste de entre 10 y 30 nucleótidos.

7. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la zona del cebador o cada una de las zonas del cebador conste de entre 17 y 30 nucleótidos.

8. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la zona del cebador o cada una de las zonas del cebador esté separada de la zona del marcador por un tramo de 20 a 50 nucleótidos.

9. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula del ácido nucleico esté etiquetada.

10. Un método de producir un marcador de seguridad según la Reivindicación 9, en el que la etiqueta sea un tinte fluorescente.

11. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, constando adicionalmente de una etiqueta separada calorimétrica y/o fluorescente.

12. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula del ácido nucleico conste de un agente bloqueador en uno o ambos extremos.

13. Un método de producir un marcador de seguridad según la Reivindicación

12, en el que el agente bloqueador consta de un compuesto de fosfotioato, un nuclesoide no natural, un dendrómero o un grupo amino alquílico.

14. Un método de producir un marcador de seguridad según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula del ácido nucleico conste adicionalmente de uno o más agentes vinculantes ligados a la molécula del ácido nucleico.

15. Un método de producir un marcador de seguridad según la Reivindicación 14, en el que el agente vinculante sea biotina, vitamina E, colesterol o un fosfotioato.

16. Un método de producir un marcador de seguridad y vincular dicho marcador a un objeto y/o persona, dicho método comprendiendo:

(i) producción de dicho marcador de seguridad por un método según cualquiera de las Reivindicaciones 1-15 y

(ii) aplicación de dicho marcador de seguridad a un objeto.

17. Un método según la Reivindicación 16, en el que el marcador de seguridad es aplicado por medio de un cepillo, un pulverizador, un aerosol o un chorro.

18. Un método según las 1. o 17, en el que el objeto es un ser humano.

19. Un método de producir y vincular un marcador de seguridad a un objeto y/o persona seguido por la detección de dicho marcador de seguridad, dicho método comprendiendo:

(i) producción y vinculación de dicho marcador de seguridad por un método según cualquiera de las Reivindicaciones 16-18; y

(ii) detección de dicho marcador de seguridad por:

(a) obtención de una muestra de un objeto que ha sido etiquetado con dicho marcador de seguridad;

(b) amplificación de la secuencia del ácido nucleico del marcador de seguridad con dos cebadores capaces de vincularse selectivamente al ácido nucleico del marcador, en el que el primer cebador se vincula a una secuencia complementaria a la zona del primer cebador y el segundo cebador se vincula a la zona del segundo cebador; e

(c) identificación de fragmentos amplificados que contienen la zona del marcador de seguridad por tamaño.

20. Un método según la Reivindicación 19, en el que el paso detectante (ii) comprende también la secuenciación de cualquier marcador de seguridad identificado desde al menos un cebador para determinar la secuencia de un ácido nucleico de la zona del marcador dentro del marcador de seguridad, en el que el marcador de seguridad identificado por el método es preferiblemente amplificado antes de la secuenciación de la zona del marcador.

21. Un método según la Reivindicación 19 o la Reivindicación 20, en el que el marcador de seguridad se investigue adicionalmente con una sonda teniendo una zona complementaria a la zona del marcador.

22. Un método según la Reivindicación 20, en el que dicha secuenciación es por secuenciación dideoxy o de espectrometría de masa.

23. Un método según cualquiera de las 1. a 22, en el que la secuencia de la zona del marcador se compara con una base de datos para determinar la fuente del marcador de seguridad.