Sistema de expresión.

Sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicasperfectas para la expresión de proteínas en células procariotas

, que comprende:

a) un promotor; y

b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia deoperador en el sentido de 3' del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en elsentido de 5' del promotor;

caracterizado porque el promotor no es de T7.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2007/000351.

Solicitante: FUJIFILM DIOSYNTH BIOTECHNOLOGIES UK LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Belasis Avenue Billingham TS23 1LH REINO UNIDO.

Inventor/es: HODGSON,IAN JOHN, LENNON,CHRISTOPHER DAVID JOHN, KARA,BUHPENDRA VALLABH.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/70 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli)

PDF original: ES-2436883_T3.pdf

 

google+ twitter facebookPin it
Sistema de expresión.

Fragmento de la descripción:

Sistema de expresión La presente invención se refiere a un sistema de expresión adecuado para la expresión microbiana de polipéptidos recombinantes.

Se conocen sistemas de expresión de proteínas basados en secuencias de operador palindrómicas perfectas basadas en T7 a partir de la patente US 6.537.779. Los sistemas basados en T7 presentan inconvenientes porque el funcionamiento del sistema de T7 requiere polimerasa de fago que se proporciona comúnmente insertando un profago !DE3 que expresa la polimerasa de fago requerida en la cepa huésped de Escherichia coli para crear cepas huésped lisogénicas. La polimerasa de fago también puede suministrarse a la célula mediante infección con un fago de transducción ! especializado que porta el gen para la polimerasa de fago (por ejemplo ARN polimerasa de T7) . El profago !DE3 carece de los elementos genéticos requeridos para la escisión del profago para formar partículas de fago líticas. Sin embargo, se ha mostrado que cepas huésped lisogénicas de !DE3 liberan partículas de fago y por tanto provocan infecciones no deseadas en plantas de fermentación. De hecho, no se permite el uso de cepas de !DE3 a determinados operadores de plantas de fermentación.

La expresión de la proteína heteróloga antes de la inducción no es deseable porque algunas proteínas heterólogas tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la célula huésped y la estabilidad del plásmido lo que reduce la productividad global. Para evitar esto, los sistemas de expresión basados en T7 controlan generalmente la expresión de proteínas heterólogas en dos niveles. En primer lugar, se requiere la inducción de la expresión del gen de ARN polimerasa de T7 para producir ARN polimerasa de T7 para impulsar la expresión a partir del promotor de T7. En segundo lugar, también se necesita inducir el propio promotor de T7. Esto aumenta la complejidad del funcionamiento de los sistemas de expresión basados en T7.

Existe un gran número de sistemas de expresión de proteínas heterólogas con diferentes modos de control e inducción, haciendo que la selección y optimización del sistema de expresión/procedimiento de fermentación para proteínas de interés sea un procedimiento ampliamente empírico. Esto requiere mucho tiempo y no se desea. Por tanto, hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar un control mejorado de la expresión y niveles mejorados de expresión de proteínas sin el uso de polimerasa de fago ni cepas huésped lisogénicas. También hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar una expresión heteróloga inducible en células procariotas, así como en células eucariotas tales como células de mamíferos y levaduras.

Según la presente invención, se proporciona un sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicas perfectas para la expresión de proteínas en células procariotas que comprende:

a) un promotor; y

b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;

caracterizado porque el promotor no es de T7.

Promotores que pueden emplearse en el sistema de expresión de la presente invención son comúnmente sistemas de promotor basados en ARN polimerasa de huésped, y preferiblemente sistemas de promotor basados en ARN polimerasa de E. coli. Los ejemplos de promotores que pueden emplearse incluyen T7A1, T7A2, T7A3, !pL, !pR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA y rrnB.

Las secuencias de operador que pueden emplearse en el sistema de expresión según la presente invención incluyen lac, gal, deo y gln. En muchas realizaciones preferidas, se emplean dos secuencias de operador palindrómicas perfectas. Cuando se emplean dos sistemas de operador, las secuencias de operador están preferiblemente separadas para maximizar el control del promotor. En muchas realizaciones, la separación es de desde 85 hasta 150 pares de bases, preferiblemente desde 90 hasta 126 pares de bases y lo más preferiblemente de 91 ó 92 pares de bases. En determinadas realizaciones, una secuencia de operador se solapa con el punto de inicio transcripcional.

Se reconocerá que el sistema de operador se emplea comúnmente con una secuencia represora apropiada. Las secuencias represoras producen proteína represora, por ejemplo la secuencia génica de lacl cuando se usan operadores de lac. También pueden usarse otras secuencias represoras de lac, por ejemplo puede usarse la secuencia laclQ para aumentar el nivel de la proteína represora de lac. La secuencia represora también puede proporcionarse mediante el genoma de célula huésped o mediante el uso de un plásmido compatible adicional.

El sistema de expresión puede estar integrado en el genoma de célula huésped, pero está comprendido preferiblemente dentro de un elemento extracromosómico tal como un plásmido. Alternativamente, el sistema de expresión puede estar incorporado en vectores de fago o virales y éstos usarse para suministrar el sistema de expresión en el sistema de célula huésped. Pueden ensamblarse plásmidos o vectores de expresión mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido también comprende normalmente uno o más de los siguientes: un marcador seleccionable, por ejemplo una secuencia que confiere resistencia a antibióticos, una secuencia de estabilidad cer y un casete de expresión. El sistema de expresión también incorpora una secuencia señal si se requiere secreción de la proteína deseada.

La expresión puede inducirse mediante la adición de un inductor tal como isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) , análogos de IPTG tal como isobutil-C-galactósido (IBCG) , lactosa o melibiosa. Pueden usarse otros inductores y se describen más completamente en otra parte (por ejemplo véase The Operon, eds Miller and Renznikoff (1978) ) . Pueden usarse inductores individualmente o en combinación. La construcción de plásmidos o vectores de expresión apropiados resultará evidente para el científico habitual en la técnica.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea para expresar proteínas recombinantes en células huésped procariotas, y especialmente en microorganismos. Tal como se usa en el presente documento, “proteínas” se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos. Los ejemplos de células procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo células bacterianas gram-negativas, incluyendo E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens y Pseudomonas aeruginosa, y células bacterianas gram-positivas incluyendo Bacillus subtilis.

Células huésped preferidas son bacterias, particularmente enterobacteriáceas, preferiblemente E. coli, y especialmente cepas B o K12 de la misma.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea comúnmente en forma de un plásmido, y plásmidos que comprenden un promotor y dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor, en el que los promotor no es de T7, forman otro aspecto de la presente invención. Los plásmidos pueden ser plásmidos de replicación autónoma o plásmidos de integración.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea para la fabricación de proteínas recombinantes, mediante el cultivo de células recombinantes. Para la expresión de proteínas recombinantes, se reconocerá que el promotor y la secuencia de operador están operativamente unidos a ADN que... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicas perfectas para la expresión de proteínas en células procariotas, que comprende:

a) un promotor; y

b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;

caracterizado porque el promotor no es de T7.

2. Plásmido para la expresión de proteínas en células procariotas que comprende:

a) un promotor; y

b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;

caracterizado porque el promotor no es de T7.

3. Plásmido según la reivindicación 2, que comprende además un casete de expresión para una proteína.

4. Plásmido según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, siendo el plásmido un plásmido de replicación autónoma.

5. Plásmido según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, siendo el plásmido un plásmido de integración.

6. Célula huésped transformada mediante un plásmido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

7. Célula huésped según la reivindicación 6, siendo la célula huésped E. coli.

8. Método para la producción de una proteína recombinante en una célula procariota que comprende expresar un sistema de expresión que comprende a) un promotor;

b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas; y

c) un casete de expresión para una proteína recombinante, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;

caracterizado porque el promotor no es de T7.

9. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en los que el promotor es un promotor de polimerasa de célula huésped.

10. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según la reivindicación 9, en los que el promotor es un promotor de ARN polimerasa de E. coli.

11. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 55 en los que el promotor es T7A1, T7A2, T7A3, !pL, !pR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA o rrnB.

12. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en los que el sistema de operador es lac, gal, deo o gln.

13. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en los que se emplean dos secuencias de operador palindrómicas perfectas.

14. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según la reivindicación 13, en los que las secuencias de operador están separadas por desde 85 hasta 150 pares de bases.

15. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según la reivindicación 14, en los que las

secuencias de operador están separadas por 91 ó 92 pares de bases.

16. Método para producir una proteína recombinante, que comprende:

a) cultivar una célula huésped procariota transformada con un plásmido según la reivindicación 3; y b) recuperar la proteína.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la célula huésped es E. coli.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, en el que el plásmido es un plásmido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15.