Sistema de ensayo para proteínas transportadoras.

Una preparación de membranas de células de insectos o preparación de células de insectos cargada con colesterol para estudiar la interacción de un compuesto y una proteína transportadora ABC

(casete de unión a ATP) determinando la actividad de dicha proteína transportadora ABC,

comprendiendo dicha preparación un mayor nivel de colesterol en las membranas en comparación con el nivel de colesterol fisiológico del mismo tipo de membrana de células de insectos, comprendiendo dicha preparación de membranas de células de insectos o preparación de células de insectos una proteína transportadora ABC, en donde dicha proteína transportadora ABC es ABCG2 (proteína transportadora ABC G2) o ABCB11 (una proteína transportadora ABC B11),

teniendo dichas ABCG2 o ABCB11 una mayor actividad de transporte de sustrato en comparación con la actividad de transporte de sustrato de dicha proteína ABCG2 o ABCB11 si está presente en el mismo tipo de membrana de célula de insectos que tiene un nivel de colesterol fisiológico.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/HU2007/000041.

Solicitante: Solvo Biotechnology.

Nacionalidad solicitante: Hungría.

Dirección: Közép fasor 52 6726 Szeged HUNGRIA.

Inventor/es: KRAJCSI, PETER, SZENTE, LAJOS, NEMETH, ATTILA, SARKADI, BALAZS, BÁTHORI,GYÖRGY, MÉHN,DÓRA, PÁL,ÁKOS, FENYVESI,ÉVA, TELBISZ,ÁGNES, VÁRADI,ANDRÁS, GEDEY,SZILVIA, GLAVINAS,HRISTOS, KIS,EMESE, NAGY,TÜNDE, MOLNÁR,ÉVA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))

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Fragmento de la descripción:

Sistema de ensayo para proteínas transportadoras La invención proporciona una nueva preparación de membranas de células de insectos cargadas con colesterol que tiene un mayor nivel de colesterol en comparación con los niveles de colesterol fisiológicos de las membranas de células de insectos o preparaciones de membranas de células de insectos de control sin carga de colesterol, en donde dicha preparación de membranas cargadas con colesterol comprende una proteína transportadora ABC que tiene una mayor actividad de transporte de sustrato debido al mayor nivel de colesterol de la membrana. La invención se refiere también a kits de reactivos que comprenden las preparaciones de la invención. La invención se refiere también a métodos para la fabricación de dicha preparación y a métodos para medir cualquier tipo de actividad de los transportadores ABC presentes en las membranas cargadas con colesterol, a métodos para estudiar o analizar compuestos y la interacción de los compuestos y los transportadores ABC en este sistema de ensayo, así como a métodos para aumentar la actividad de transporte de sustrato de los transportadores ABC aumentando el nivel de colesterol de las membranas. La invención proporciona también un sistema de ensayo útil para analizar si las proteínas transportadoras ABC pueden ser activadas por colesterol en una membrana de células de insectos.

Técnica anterior

Proteínas transportadoras ABC

Las proteínas de la superfamilia de transportadores casete de unión a ATP (abreviadamente ABC, por la expresión inglesa ATP binding cassette) forman la mayor familia de proteínas transmembránicas. La mayor parte de ellas son proteínas transportadoras que utilizan la energía de hidrólisis de ATP para bombear sustratos a través de membranas intra- y extra-celulares. El transporte en la mayoría de los casos es unidireccional; los eucariotas efluyen generalmente sustratos desde el citoplasma hasta la matriz extracelular. La familia de transportadores incluye muchos miembros (actualmente se conocen 49 proteínas ABC humanas) que se clasificaron después de un análisis filogenético en 7 subfamilias (desde ABCA-ABCG) [Dean, M, Rzetsky, A és Allikmets R., "The Human ATP-Binding Cassette (ABC) Transporter Superfamily", Genome Res. 2001 11, 1156-1166]. Los transportadores ABC desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la salud y el funcionamiento del cuerpo. Su deficiencia o mal funcionamiento pueden conducir a enfermedades, como las enfermedades hereditarias. La investigación que se centra en su papel fisiológico se encuentra todavía en una etapa relativamente temprana.

Dentro de la superfamilia de transportadores ABC, varios transportadores actúan como un transportador resistente a multifármacos. Los transportadores resistentes a multifármacos son proteínas transportadoras capaces de extruir desde la célula por transporte activo una variedad de compuestos xenobióticos, incluyendo los fármacos. En muchos casos el aumento de su actividad puede conducir a la resistencia frente a la terapia con fármacos. Se ha demostrado que varios miembros de la familia de transportadores, por ejemplo, MDR1, MRP1 y ABCG2 (MXR/BCRP) desempeñan un papel en el desarrollo de la resistencia a fármacos. Los transportadores influyen significativamente en la cinética de absorción de los fármacos, incluso sin sobreexpresión ni amplificación de la actividad. Como varios fármacos son sustratos de un transportador multifármacos, durante el desarrollo de los fármacos es de importancia crucial excluir del círculo de moléculas candidatas al fármaco potencial las que pueden ser sustratos de dichos transportadores, ya en una fase temprana (ADME tempranas, siendo ADME un acrónimo de "Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción") .

Ensayos para el estudio de los transportadores de membranas Los transportadores de membranas se estudian habitualmente en ensayos celulares o a base de membranas. Para los ensayos de membranas los transportadores de interés se sobreexpresan en sistemas celulares y después de la expresión de los transportadores, se aíslan de estas células preparaciones de membranas. Para la expresión de las proteínas se aplican con frecuencia sistemas de expresión basados en células de insectos, como el sistema de insectos-Baculovirus. Las células de insectos proceden frecuentemente de las células de ovario de la polilla, Spodoptera frugiperda: un ejemplo son las células Sf9.

Por lo tanto, los métodos para la investigación de los transportadores ABC son particularmente importantes; para este fin se aplican usualmente ensayos de membranas. Solvo, la firma solicitante es también distribuidora de varios ensayos de membranas que son adecuados para estudiar las interacciones entre los transportadores y los fármacos candidatos o principales. Solvo ha desarrollado un ensayo de membranas utilizando membranas procedentes de células de mamíferos que expresan ABCG2 (MXR-M) .

La actividad del transporte se suele medir: i) bien por la tasa de consumo de ATP, ii) o se monitoriza el transporte de sustratos marcados. En los ensayos de ATPasa (i) el transporte en sí no se mide directamente, sino por medio de la estimulación por el sustrato de la actividad de ATPasa, debido a que los sustratos transportados mejoran la actividad de la ATPasa por lo que se denominan también activadores. Entre ensayos de transporte (ii) la determinación del transporte vesicular es particularmente importante en el estudio de los transportadores. En este ensayo se utilizan vesículas inversas de membranas celulares de insectos; y el sustrato es transportado a la vesícula, donde se acumula y se puede detectar.

Es de importancia fundamental que los modelos in vitro imiten estrechamente el fenotipo fisiológico.

Las membranas preparadas a partir de sistemas de expresión de seres humanos u otros mamíferos han sido ampliamente utilizadas en el campo de los transportadores ABC. Desgraciadamente, estos sistemas de expresión proporcionan generalmente niveles de expresión significativamente menores que son insuficientes para medir la actividad de ATPasa del transportador. Por otra parte, mientras que el transportador que se va a ensayar debe ser sobreexpresado, otros transportadores expresados por la célula hospedante de mamífero pueden contribuir a un fondo o dar como resultado un efecto perturbador, en particular, si se solapan las especificidades del sustrato de las proteínas transportadoras.

Sistemas de expresión de células de insectos más robustos proporcionan por lo general mayores tasas de expresión y tienen la clara ventaja de estar libres de otros transportadores, por lo tanto se puede estudiar uno y sólo un tipo de proteína transportadora. Los ensayos basados en preparaciones de membranas de células de insectos son particularmente preferidos por ser estables, fiables, fáciles de manipular y se ofrecen con frecuencia varios formatos de ensayo (ATPasa estimulada por sustratos, transporte vesicular y/u oclusión de nucleótidos) .

Sin embargo, ensayos basados en preparaciones de células de insectos y en membranas de células de insectos, eficaces y convenientes por otra parte, muestran ciertas diferencias perturbadoras en comparación con los ensayos basados en células de mamíferos, lo que cuestiona su valor como un sistema de ensayos útil y relevante en el desarrollo de fármacos.

Está documentado que para ciertos transportadores ABC, por ejemplo, en el caso de MDR1 (ABCB1) así como de ABCG2, una alta actividad de ATPasa basal hace menos sensibles los ensayos de ATPasa estimulada por sustratos. Se ha sugerido que la actividad de ATPasa basal, medida en ausencia de sustratos añadidos, puede ser debida a la activación por sustratos endógenos, o puede reflejar una actividad de ATPasa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una preparación de membranas de células de insectos o preparación de células de insectos cargada con colesterol para estudiar la interacción de un compuesto y una proteína transportadora ABC (casete de unión a ATP) determinando la actividad de dicha proteína transportadora ABC,

comprendiendo dicha preparación un mayor nivel de colesterol en las membranas en comparación con el nivel de colesterol fisiológico del mismo tipo de membrana de células de insectos, comprendiendo dicha preparación de membranas de células de insectos o preparación de células de insectos una proteína transportadora ABC, en donde dicha proteína transportadora ABC es ABCG2 (proteína transportadora ABC G2) o ABCB11 (una proteína transportadora ABC B11) ,

teniendo dichas ABCG2 o ABCB11 una mayor actividad de transporte de sustrato en comparación con la actividad de transporte de sustrato de dicha proteína ABCG2 o ABCB11 si está presente en el mismo tipo de membrana de célula de insectos que tiene un nivel de colesterol fisiológico.

2. La preparación de la reivindicación 1, en donde el nivel de colesterol en la membrana es:

- al menos 50% del nivel de colesterol correspondiente de una membrana de célula de mamífero,

o

- al menos 2 veces el nivel de colesterol endógeno de una membrana de célula de insecto.

3. La preparación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la actividad de transporte de sustrato es al menos 1, 5 veces mayor que la actividad de transporte de sustrato de dicha proteína transportadora ABC si está presente en una preparación de membranas de células de insectos de control del mismo tipo que tiene un nivel de colesterol fisiológico cuando se analiza por:

a) un ensayo de transporte vesicular y/o b) un ensayo de ATPasa estimulada por sustrato.

4. Un kit de reactivos para determinar la actividad de ATPasa estimulada por sustrato o de transporte vesicular de una proteína transportadora ABC, en donde dicha proteína transportadora ABC es ABCG2 o ABCB11, compren25 diendo dicho kit:

- la preparación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y/o

- medios para expresar ABCG2 o ABCB11 como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en células de insectos y medios para cargar las células de insectos con colesterol y opcionalmente medios para preparar una preparación de membranas a partir de las células de insectos, y

- si se desea, cualquiera de los siguientes: sustratos de la proteína transportadora ABC, ATP, colesterol, tampones, reactivos, controles, inhibidores o activadores de la proteína transportadora ABC.

5. Un método para fabricar una preparación de células de insectos o una preparación de membranas de células de insectos, que comprende una proteína transportadora ABC que tiene mayor actividad de transporte de sustrato, para uso en un ensayo de proteína transportadora ABC,

en donde dicho método comprende:

- proporcionar ABCG2 o ABCB11 en una preparación de células de insecto o en una preparación de membranas de células de insectos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

- cargar la preparación de células de insectos o la preparación de membranas de células de insectos con co

lesterol, con lo cual se aumenta el nivel de colesterol de la preparación de células de insectos o de la preparación de 40 membranas de células de insectos.

6. Un método de ensayo para estudiar la interacción de un compuesto y una proteína transportadora ABC determinando la actividad de dicha proteína transportadora ABC, en donde dicho método de ensayo comprende las etapas de:

- proporcionar una proteína ABCG2 o ABCB11 activa en una preparación de membranas de células de insectos o de membranas de células de insectos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 u obtenible por un método de acuerdo con la reivindicación 5,

- poner en contacto un compuesto con la proteína ABCG2 o ABCB11,

- medir la actividad de transporte de sustrato de la proteína ABCG2 o ABCB 11 por un ensayo de ATPasa es50 timulada por sustrato y/o por un ensayo de transporte vesicular en presencia y en ausencia de dicho compuesto,

- comparar los valores de actividad obtenidos en presencia y ausencia del compuesto, en donde la preparación de células de insectos o la preparación de membranas de células de insectos tiene un mayor nivel de colesterol en comparación con el nivel de colesterol fisiológico de membranas de células de insectos.

7. Un método de ensayo de la reivindicación 6 para analizar la interacción simultánea de al menos dos compuestos y una proteína ABCG2 o ABCB11 determinando la actividad de la proteína transportadora, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:

- proporcionar una proteína activa ABCG2 o ABCB11 en una preparación de células de insectos o en una

preparación de membranas de células de insectos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 u obte10 nible por un método de acuerdo con la reivindicación 5,

-poner en contacto un primer compuesto con la proteína ABCG2 o ABCB11,

- medir la actividad de transporte de sustrato de la proteína ABCG2 o ABCB11 por un ensayo de ATPasa estimulada por sustrato y/o la actividad de transporte vesicular en presencia y ausencia de dicho primer compuesto,

-comparar los valores de actividad obtenidos en presencia y en ausencia de dicho primer compuesto,

- poner en contacto un segundo compuesto con la proteína transportadora ABC en presencia del primer compuesto,

-medir la actividad de transporte de sustrato de la proteína transportadora ABC por un ensayo de ATPasa estimulada por sustrato y/o la actividad de transporte vesicular en presencia del primero y segundo compuesto simultáneamente,

- comparar los valores de actividad obtenidos en presencia y en ausencia del segundo compuesto,

-evaluar el efecto del segundo compuesto sobre la actividad en presencia del primer compuesto,

en donde la preparación de células de insectos o la preparación de membranas de células de insectos es una preparación como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un uso de colesterol para aumentar la actividad de transporte de sustrato en un ensayo para estudiar la interacción de un compuesto y una proteína ABCG2 o ABCB11 determinando la actividad de una proteína transportadora ABC insertada en una membrana de células de insectos o en una preparación de células de insectos o en una preparación de membranas de células de insectos.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde se usa colesterol en forma de un complejo de colesterol y una ciclodextrina.

10. Un uso de una preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una preparación obtenible por un método de acuerdo con la reivindicación 5, en un ensayo de la proteína ABCG2 o ABCB11 para estudiar la interacción de un compuesto y una proteína ABCG2 o ABCB11 determinando la actividad de dicha proteína ABCG2

o ABCB11.

11. El uso de la reivindicación 10, en donde la actividad de la proteína transportadora ABC se analiza por:

a) un ensayo de transporte vesicular y/o b) un ensayo de ATPasa estimulada por sustrato.