Sistema de circulación.

Sistema de circulación (1), que es autónomo y comprende:

a.

al menos una sección de crecimiento de capilares (2), que comprende al menos dos microentradas (3) y dos microsalidas (4),

b. un dispositivo de bombeo direccional (5), y

c. un canal de transporte arteriolar (6) que conecta el dispositivo de bombeo direccional (5) y las al menos dos entradas (3) y un canal de transporte venular (7) que conecta el dispositivo de bombeo direccional (5) y las al menos dos salidas (4),

en el que está prevista una subsección (16) dentro de la sección de crecimiento de capilares (2) que carece de microentradas (3) y de salidas (4) y en la que la subsección (16) está suficientemente retirada de las correspondientes microentradas ( 3) y microsalidas (4), de modo que la formación de capilares (14) se ve debilitada en esta subsección, en el que la subsección (16) tiene una distancia de al menos 100 μm y hasta 500 μm de las microentradas (3) y/o de las microsalidas (4).

Sistema de circulación.

Introducción

Esta invención se refiere a un sistema de circulación autónomo que facilita la formación de capilares en secciones de crecimiento de capilares y permite la formación de microorganoides y/o secciones de microtejido para monitorizar el efecto de uno o más compuestos de ensayo y determinar la eficacia, los efectos secundarios, la bioseguridad, los metabolltos, el modo de acción o la regeneración de órganos, así como métodos para establecer tales microorganoides y/o microtejido en tal sistema de circulación autónomo.

Antecedentes de la Invención

Se han realizado enormes esfuerzos para desarrollar sistemas de circulación para el suministro de nutrientes fisiológicos y la eliminación de desechos de tejidos cultivados ¡n vltro. Estos desarrollos tienen como objetivo la generación ¡n vltro de equivalentes de órganos, tales como el hígado, los nodos linfáticos (Glese et al., 21, Journal of Blotechnology 148, 38-45) y el pulmón (Huh et al., 21, Science, (328) 5986, págs. 1662 - 1668) o incluso de sistemas multlorgánlcos (Sonntag et al., 21, Journal of Biotechnology 148, 7-75) para ensayos de sustancias, la Investigación sobre la regeneración de órganos o para la fabricación de trasplantes. Inlclalmente los sistemas técnicos de perfusión basados en membranas, fibras huecas (Catapano y Gerlach, Bloreactors for Liver Tissue Englneerlng. 2. Toplcs ¡n Tissue Englneerlng, Vol. 3, 27,1-42 Eds. N Ashammakhl, R Reís & E Chiellini ) o redes de mlcrocanales (Du et al., Capítulo 7:Microfluidic Systems for Englneerlng Vascularlzed Tissue Constructs" 28 (Capítulo de libro )) fueron utilizados para estos propósitos.

En un sistema de soporte hepático desarrollado por Gerlach y colaboradores tres haces de fibras huecas son entretejidos entre sí, formando múltiples microespacios de cultivo idénticos para la perfusión de plasma y el suministro de oxígeno. La perfusión de plasma humano está asegurada por dos haces de membrana de fibra hueca de microfiltración, mientras que la oxigenación tiene lugar a través de una membrana de transporte de oxígeno Impermeable al líquido. Sistemas de soporte hepáticos basados en este principio han funcionado bien durante varias semanas, estando incluidos en un circuito de flujo de plasma de los pacientes.

Du et al. reunieron plataformas fluídicas para la generación de construcciones de tejido microvascularizado basadas en hidrogeles y técnicas de microfabricaclón. La visión general destaca la capacidad técnica para formar una red de capilares sanguíneos como estructuras de canales dentro de materiales poliméricos para la perfusión eficiente de líquido a través de cultivos de tejido. La mayoría de los microsistemas resultantes fueron utilizados para la perfusión técnica de alta eficacia sin incluir células endoteliales.

Tales sistemas están limitados al uso de medios de cultivo o plasma, pero no permiten la perfusión de sangre completa debido a los fenómenos de coagulación. Además no proporcionan la barrera de tejido sanguíneo natural, que in vivo está compuesta por una capa de células endoteliales cerradas. Esto permite el transporte activo a través de la capa de células, así como la señalización del tejido en la red capilar. Se han desarrollado diferentes enfoques para sistemas de perfusión técnica en línea (Song et al., 25, Anal. Chem, 25, 77, 3993-3999 ) o matrices sintéticas o biológicas (Zhang et al., 29, Biomaterials, 3 (19): 3213-3223; Walles, 21, Journal of Biotechnology 148, 56-63) con células endoteliales.

Song y sus colaboradores desarrollaron un soporte microcirculatorio para cultivar células endoteliales sometidas a tensión de cizalladura definida. Monocapas cerradas de células endoteliales pudieron establecerse en compartimentos de cultivo de células individuales situados entre los canales de transporte técnico.

Para generar injertos vasculares elaborados con ingeniería tisular (TGVG) Zhang et al. desarrollaron una construcción elaborada con Ingeniería tisular que imitaba la estructura de los vasos sanguíneos utilizando soportes tubulares de fibroína de seda electrohilados con propiedades mecánicas adecuadas. Sembraron células de músculo liso de arteria coronaria humana (HCASMC) y células endoteliales de arteria aórtica humana (HAEC) sobre la superficie luminal de los soportes tubulares y fueron cultivadas bajo flujo pulsátil fisiológico, que fue generado dentro del biorreactor de doble bucle usando tubos externos y bombas.

Una matriz totalmente biológica para el establecimiento de una vasculatura endotelializada in vitro fue usada por Walles et al. conectando tubos poliméricos y un sistema de bombeo controlado a un segmento de intestino animal descelularizado. En este sistema los capilares que están totalmente cubiertos por células endoteliales se limitan a las áreas funcionalmente relevantes de la biomatriz.

El documento US 24/23147 A1 se refiere a métodos y estructuras para el crecimiento de tejido orgánico vivo.

El documento US 27/224677 A1 se refiere a métodos para la creación de sistemas de microvasos perfundibles.

El documento US 29/191631 A1 se refiere a placas de Petri 3D para el cultivo y estudios de células.

Sin embargo, ninguno de los sistemas de circulación de la técnica anterior era adecuado para el cultivo de tejido a largo plazo basado en sangre completa como se proporciona en esta solicitud.

La presente invención se refiere a un sistema de circulación cerrado y autónomo que emula el entorno de perfusión de la sangre natural de los vertebrados a nivel tisular. El sistema utiliza una circulación de la sangre fisiológica en miniatura para proporcionar circulación de un volumen de microlitros para soportar miligramos de tejido. Esto imita la relación fisiológica de los seres humanos, donde litros de volumen de sangre soportan kilos de tejido a una microescala compatible con un chip. El sistema de circulación autónomo contiene al menos una sección de crecimiento de capilares situada entre las microentradas y las microsalidas del sistema.

Una sección de crecimiento de capilares para la formación de capilares sanguíneos que permiten el intercambio de nutrientes está integrada en la circulación, además de una bomba en miniatura y canales de transporte.

Breve sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema de circulación (1) que es autónomo y comprende:

a. al menos una sección de crecimiento de capilares (2), que comprende al menos dos microentradas (3) y dos microsalidas (4),

b. un dispositivo de bombeo direccional (5), y

c. un canal de transporte arteriolar (6) que conecta el dispositivo de bombeo direccional (5) y las al menos dos entradas (3) y un canal de transporte venular (7) que conecta el dispositivo de bombeo direccional (5) y las al menos dos salidas (4), en el que está prevista una subsección (16) dentro de la sección de crecimiento de capilares que carece de microentradas y salidas y tiene una distancia de al menos 1 pm y hasta 5 pm de las microentradas y/o salidas.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para establecer un sistema de circulación (1) de la invención, que comprende las etapas de:

a. siembra de células endoteliales en el sistema de circulación (1), e

b. incubación al menos hasta que se hayan formado capilares (14) en la sección de crecimiento de capilares (2) y/o hasta que una capa de células endoteliales se haya formado en los canales de transporte y/o hasta que una capa de células endoteliales haya cubierto todas las superficies interiores del dispositivo de bombeo (5).

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso del sistema de circulación (1) según la presente invención, o que puede ser producido según la presente invención, para monitorizar el efecto de uno o más compuestos de ensayo y/o para la determinación de la eficacia, los efectos laterales, la bioseguridad, los metabolitos, el modo de acción o la regeneración de órganos.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir en detalle la presente invención a continuación hay que entender que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. Hay que entender también que la terminología usada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se determine lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento... [Seguir leyendo]

1. Sistema de circulación (1), que es autónomo y comprende:

a. al menos una sección de crecimiento de capilares (2), que comprende al menos dos microentradas (3) y dos microsalidas (4),

b. un dispositivo de bombeo direccional (5), y

c. un canal de transporte arteriolar (6) que conecta el dispositivo de bombeo direccional (5) y las al menos dos entradas (3) y un canal de transporte venular (7) que conecta el dispositivo de bombeo direccional (5) y las al menos dos salidas (4),

en el que está prevista una subsección (16) dentro de la sección de crecimiento de capilares (2) que carece de microentradas (3) y de salidas (4) y en la que la subsección (16) está suficientemente retirada de las correspondientes microentradas ( 3) y microsalidas (4), de modo que la formación de capilares (14) se ve debilitada en esta subsección, en el que la subsección (16) tiene una distancia de al menos 1 pm y hasta 5 pm de las microentradas (3) y/o de las microsalidas (4).

2. Sistema de circulación (1) según la reivindicación 1, en el que el sistema de circulación (1) comprende al menos dos secciones de crecimiento de capilares (2).

3. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que una sección de crecimiento de capilares (2) es al menos en parte permeable al gas.

4. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sección de crecimiento de capilares (2) comprende o consiste en una matriz blocompatlble semlsóllda (8) y/o fibras huecas biocompatibles semisólidas (9), en el que la matriz blocompatlble (8) comprende opclonalmente microcanales, estructuras y/o redes que permiten la formación de capilares (14) por las células endoteliales.

5. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sección de crecimiento de capilares (2) comprende además un colector de fluidos y/o residuos extracapilares (1).

6. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en el que el colector de fluido y/o residuos extracapllares (1) está separado de la matriz biocompatible (8) y/o de la fibra hueca biocompatible (9) por una membrana de retención de células o por canales de exclusión de células (11) y en el que opcionalmente al menos un sensor (12) está dispuesto en el colector de fluidos y/o residuos extracapilares (1).

7. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además capilares (14) y/o organoides (15) formados en la sección de crecimiento de capilares (2).

8. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dos o más tejidos y/o organoides (15) diferentes son mantenidos dentro de un sistema autónomo, los cuales son perfundidos por el mismo fluido circulante.

9. Sistema de circulación (1) según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la subsección (16) tiene una distancia de 1 pm a 3 pm de las microentradas (3) y/o microsalidas (4).

1. Sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el canal de transporte arteriolar (6) se ramifica al menos una vez para conectar con las al menos dos entradas (3), y el canal de transporte venular (7) se ramifica al menos una vez para conectar con las al menos dos salidas (4), respectivamente.

11. Sistema de circulación (1) según la reivindicación 1, en el que

a. el área combinada de la sección transversal de los canales arteriolares después del punto de ramificación (13) es esencialmente idéntica al área de la sección transversal del canal arteriolar delante del punto de ramificación (13) y/o el área combinada de la sección transversal de los canales de transporte venulares (7) después del punto de ramificación (13) es esencialmente idéntica al área de la sección transversal del canal venular delante del punto de ramificación (13) y/o

b. el área combinada de la sección transversal de todas las entradas (3) es esencialmente idéntica al área de la sección transversal de dicho canal arteriolar y/o canales arteriolares y el área combinada de la sección transversal de todas las salidas (4) es esencialmente idéntica al área de la sección transversal de dicho canal venular y/o canales venulares, preferiblemente las áreas de las secciones transversales de los canales arteriolares y venulares son idénticas.

12. Método para establecer un sistema de circulación (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende las etapas de:

a. siembra de células endoteliales en el sistema de circulación (1), e

b. incubación al menos hasta que se hayan formado los capilares (14) en la sección de crecimiento de capilares (2) y/o hasta que una capa de células endoteliales se haya formado en los canales de transporte y/o hasta que una capa de células endoteliales haya cubierto todas las superficies interiores del dispositivo de bombeo (5).

13. Método para establecer un sistema de circulación (1) según la reivindicación 12, en el que:

(a) el método comprende además la etapa de inyectar sangre completa en dicho sistema de circulación o

(b) la etapa b) es realizada cabo bajo fuerza de cizalladura.

14. Uso del sistema de circulación (1) según las reivindicaciones 1 a 11 para monitorizar el efecto de uno o más compuestos de ensayo y/o para la determinación de la eficacia, los efectos secundarios, la bioseguridad, los 1 metabolitos, el modo de acción o la regeneración de órganos.