Sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alergénico y/o irritante de una sustancia.

Un método para estudiar el efecto sensibilizante, alergénico y/o irritante de un agente,

que comprende:

a) poner en contacto la superficie de un modelo de epidermis contenido en un primer compartimento, con el agente; y

b) determinar la actividad de un cultivo celular de células inmunológicas contenido en un segundo compartimento, en el que el primer compartimento y el segundo compartimento están separados por una capa intermedia permeable, en el que la presencia de una célula inmunológica activada en el segundo compartimento indica que el agente es un alergeno o un agente irritante, y

en el que la actividad de las células inmunológica se determina realizando una o más de las siguientes etapas:

identificar la proliferación de las células inmunológicas; medir los marcadores de superficie de las células inmunológicas; medir los componentes de transducción de señales de las células inmunológicas; medir las citoquinas intracelulares de las células inmunológicas; y analizar los niveles de ARN mensajero dentro de las células inmunológicas.

Sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alergïnico y/o irritante de una sustancia Antecedentes La alergia es un trastorno del sistema inmunolïgico que incluye la atopïa. Las reacciones alïrgicas se producen en respuesta a sustancias ambientales conocidas como alergenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rïpidas. La alergia se caracteriza por una activaciïn excesiva de ciertos leucocitos, conocidos como cïlulas cebadas, y basïfilos, por un tipo de anticuerpo, conocido como IgE, que provoca una respuesta inflamatoria extrema. Las reacciones alïrgicas comunes incluyen eccema, urticaria, fiebre del heno, asma, alergias alimentarias, y reacciones al veneno de insectos que pican, tales como avispas y abejas.

Se conocen diferentes tipos de alergenos. Los alergenos inhalados incluyen polvo o aerosoles, por ejemplo, polen o polvo domïstico. Los alergenos alimentarios son sustancias contenidas en los alimentos a las que el cuerpo reacciona mediante hipersensibilizaciïn (reacciones alïrgicas) . Los alergenos de productos medicinales comprenden ciertas sustancias activas en productos medicinales, por ejemplo, antibiïticos o analgïsicos. Un grupo particularmente importante de sustancias alergïnicas son los alergenos por contacto. Estos pueden provocar una reacciïn alïrgica en los afectados a travïs del contacto con la piel. Ciertos metales y sustancias odorïferas pertenecen a los alergenos por contacto.

En dïcadas recientes, en especial en los païses occidentales industrializados, se ha observado un aumento repentino en el nïmero de alergenos. Muchas sustancias alergïnicas son ingredientes en cosmïticos u otras sustancias de aplicaciïn tïpica (composiciones para la aplicaciïn externa local) . Los cosmïticos o agentes tïpicos se ensayan por sus propiedades alergïnicas mediante experimentos en animales. Por tanto, los descubrimientos obtenidos solo tienen un valor limitado, porque los animales experimentales no siempre reaccionan a los mismos alergenos que los seres humanos y viceversa. Esta situaciïn con frecuencia produce resultados falsos positivos y falsos negativos. Ademïs, tambiïn existen problemas prïcticos y ïticos asociados con el ensayo en animales.

El documento US 2001/0049115 describe un ensayo in vitro para ensayar el efecto inmunomodulador de un material de ensayo, que comprende colocar un soporte microporoso que tiene una monocapa de cïlulas epiteliales contenida en ïl, para que se ponga en contacto con un medio nutriente en un pocillo de cultivo.

En vista del estado de los ensayos para la actividad alergïnica, son necesarias nuevas herramientas y mïtodos eficaces para determinar la actividad alergïnica.

Sumario La presente invenciïn se refiere en general a un sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alergïnico y/o irritante de diversas sustancias.

En una realizaciïn, la presente invenciïn se dirige a un sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alergïnico y/o irritante de sustancias, que comprende: a) un primer compartimento que comprende un modelo de epidermis; y b) un segundo compartimento que comprende un cultivo celular basado en cïlulas inmunolïgicas, en el que el primer y segundo compartimento estïn separados por una capa intermedia permeable, y en el que un alergeno o agente irritante introducido en el primer compartimento activa a las cïlulas inmunolïgicas del segundo compartimento. En una realizaciïn concreta, las cïlulas inmunïlogicas son cïlulas presentadoras de antïgenos, por ejemplo, macrïfagos y/o cïlulas dendrïticas. En una realizaciïn concreta, las cïlulas inmunolïgicas son linfocitos, en particular linfocitos B y/o linfocitos T. En una realizaciïn concreta, las cïlulas inmunolïgicas presentan antïgenos de compatibilidad tisular concordantes. En una realizaciïn concreta, el cultivo de cïlulas inmunolïgicas estï sustancialmente exento de cïlulas tisulares. En una realizaciïn concreta, las cïlulas inmunïlogas se derivan de un ser humano. En una realizaciïn concreta, las cïlulas inmunolïgicas se aislan a partir de sangre. En una realizaciïn concreta, el modelo de epidermis tiene una estructura en capas. En una realizaciïn concreta, el modelo de epidermis tiene multiples capas, por ejemplo, el modelo de epidermis puede comprender al menos una capa de epidermis seleccionada del grupo que consiste en estrato cïrneo, estrato lïcido, estrato granuloso, estrato espinoso y estrato basal. En una realizaciïn concreta, el modelo de epidermis comprende cïlulas epidïrmicas vivas, por ejemplo, queratinocitos. En una realizaciïn concreta, el modelo de epidermis estï sustancialmente exento de cïlulas inmunolïgicas. En una realizaciïn concreta, el modelo de epidermis es un modelo de epidermis animal, por ejemplo, un modelo de epidermis humana. En una realizaciïn concreta, dicha una o mïs sustancias comprenden al menos un agente cosmïtico. En una realizaciïn concreta, dicha una o mïs sustancias comprenden al menos un agente medicinal farmacolïgicamente activo. En una realizaciïn concreta, el segundo compartimento se rellena con un medio acuoso.

En una realizaciïn, la presente invenciïn se dirige a un mïtodo para utilizar cualquiera de los sistemas de cultivo celular descritos en la presente para estudiar el efecto sensibilizante, alergïnico o irritante de una o mïs sustancias, que comprende poner en contacto el primer compartimento con la sustancia, y detectar una respuesta alïrgica en el segundo compartimento.

En una realizaciïn, la presente invenciïn se dirige a un mïtodo para estudiar el efecto sensibilizante, alergïnico y/o irritante de un agente, que comprende: a) poner en contacto la superficie de un modelo de epidermis contenido en un primer compartimento, con el agente; y b) determinar la actividad de un cultivo celular de cïlulas inmunolïgicas contenido en un segundo compartimento, en el que el primer compartimento y el segundo compartimento estïn separados por una capa intermedia permeable, en el que la presencia de una cïlula inmunolïgica activada en el segundo compartimento indica que el agente es un alergeno o un agente irritante. En una realizaciïn concreta, las cïlulas inmunolïgicas se aislan de la sangre. En una realizaciïn concreta, el cultivo celular comprende cïlulas presentadoras de antïgenos y linfocitos. En una realizaciïn concreta, las cïlulas presentadoras de antïgenos se derivan de monocitos bajo condiciones de diferenciaciïn. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas estudiando el sobrenadante del cultivo celular. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas ensayando las sustancias producidas por las cïlulas inmunolïgicas activadas. En una realizaciïn concreta, las sustancias producidas por las cïlulas inmunolïgicas activadas se seleccionan del grupo que consiste en transductores de seïales, receptores, enzimas y anticuerpos. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas ensayando las sustancias mensajeras procedentes de los queratinocitos del modelo de epidermis. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas identificando la proliferaciïn de las cïlulas inmunolïgicas. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas midiendo los marcadores de superficie de las cïlulas inmunolïgicas. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas midiendo los componentes de transducciïn de seïales de las cïlulas inmunologicas. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas midiendo las citoquinas intracelulares de las cïlulas inmunolïgicas. En una realizaciïn concreta, se determina la actividad de las cïlulas inmunolïgicas analizando los niveles de ARN mensajero dentro de las cïlulas inmunolïgicas.

Descripciïn detallada La presente invenciïn se dirige a proporcionar un modelo de investigaciïn extracorporal que es especïfico para alergenos. Tal como se emplea en la presente, un “alergeno” es un antïgeno no parasitario capaz de estimular una reacciïn de hipersensibilidad en individuos. En la presente se describen materiales y mïtodos que imitan, de forma satisfactoria, la compleja situaciïn fisiolïgica en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, que puede conducir a una alergia, mientras que se evita la desventaja conocida del estado actual de la tïcnica, pero al mismo tiempo se toman en cuenta los actuales desarrollos en el campo de los ensayos aprobados para cosmïticos y agentes tïpicos.

En la presente se describe un sistema de cultivo celular ïtil para investigar el efecto sensibilizante, alergïnico... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para estudiar el efecto sensibilizante, alergïnico y/o irritante de un agente, que comprende:

a) poner en contacto la superficie de un modelo de epidermis contenido en un primer compartimento, con el agente; y

b) determinar la actividad de un cultivo celular de cïlulas inmunolïgicas contenido en un segundo compartimento, en el que el primer compartimento y el segundo compartimento estïn separados por una capa intermedia permeable,

en el que la presencia de una cïlula inmunolïgica activada en el segundo compartimento indica que el agente es un alergeno o un agente irritante, y

en el que la actividad de las cïlulas inmunolïgica se determina realizando una o mïs de las siguientes etapas:

identificar la proliferaciïn de las cïlulas inmunolïgicas; medir los marcadores de superficie de las cïlulas inmunolïgicas; medir los componentes de transducciïn de seïales de las cïlulas inmunolïgicas; medir las citoquinas intracelulares de las cïlulas inmunolïgicas; y analizar los niveles de ARN mensajero dentro de las cïlulas inmunolïgicas.

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que las cïlulas inmunolïgicas se aislan a partir de sangre.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que el cultivo celular comprende cïlulas presentadoras de antïgenos y linfocitos.

4. El mïtodo de la reivindicaciïn 3, en el que las cïlulas presentadoras de antïgenos proceden de monocitos bajo condiciones de diferenciaciïn.

5. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que la actividad de las cïlulas inmunolïgicas se determina estudiando el 20 sobrenadante del cultivo celular.

6. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que la actividad de las cïlulas inmunolïgicas se determina ensayando para detectar sustancias producidas por las cïlulas inmunolïgicas activadas.

7. El mïtodo de la reivindicaciïn 6, en el que las sustancias producidas por las cïlulas inmunolïgicas activadas se seleccionan del grupo que consiste en transductores de seïales, receptores, mensajeros, enzimas y anticuerpos.

8. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que la actividad de las cïlulas inmunolïgicas se determina ensayando para detectar sustancias mensajeras procedentes de los queratinocitos del modelo de epidermis.